重要人感染RNA病毒复制机制和靶向聚合酶药物开发研究进展

近年来,拉沙热、埃博拉、新冠和尼帕等多种病毒性传染病在世界范围内频繁暴发,给人类健康和社会经济发展带来了巨大威胁。广谱抗病毒药物是主动应对新发突发病毒性传染病的重要手段之一,而其研发的关键是发现病毒特有的保守药物靶点。病毒聚合酶负责病毒基因组的复制和转录过程,蛋白序列相对保守,是理想的药物靶点。本文以重要人感染RNA病毒聚合酶的工作机制和靶向病毒聚合酶的药物开发展开综述,为未来新发突发传染性疾病防控提供新思路和新策略。

新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂研究进展

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型导致的新型冠状病毒感染席卷全球,寻找广谱抗病毒特效药一直是一项重大任务。RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶是一类不同病毒间在结构和功能上高度保守的关键非结构蛋白,针对该聚合酶为靶点开发新的小分子抑制剂至关重要。本文作者从新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结构为出发点,详细阐述了该病毒RNA依赖性RNA聚合酶的作用机制以及不同种类抑制剂的特点。着重从药物化学的角度介绍了核苷类似物和非核苷类似物的作用特点和作用机制,综述了多种小分子聚合酶抑制剂化学结构与生物活性之间的关系。

新型抗病毒RNA聚合酶PA亚基抑制剂临床研究进展

流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的对人类健康危害较重的呼吸道传染病。目前抗流感药物的应用主要面临病毒耐药性和对高致病性流感病毒的效价低的问题,如M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂存在药效低、时间窗口窄和耐药性等缺点。近来的抗流感药物研发的靶点聚焦于病毒RNA聚合酶。流感病毒RNA聚合酶是病毒在宿主细胞内完成复制和转录过程的关键酶,其中PA亚基通过内切酶活性为流感病毒的转录过程提供引物,成为潜在抗流感药物靶点。本文总结了以PA亚基内切酶为靶点的抗流感药物研究进展,旨在为开发安全有效的新型抗病毒RNA聚合酶抑制剂提供参考。

英国研究构建叶绿体RNA聚合酶原子模型

叶绿体中的RNA聚合酶比较独特,它拥有比蓝藻还多的亚基,转录机制也更复杂。为进一步探究叶绿体RNA聚合酶的结构,英国约翰英纳斯中心科研人员使用冷冻电镜,对从白芥菜提取出来的叶绿体RNA聚合酶样本进行成像,并研究分析了其中的21个亚基等结构的作用,建立了原子水平的数据模型。该模型揭示了超氧化物歧化酶、赖氨酸甲基转移酶和氨基酸连接酶(亚基)的详细信息,为进行下一步分析各个蛋白的功能,理解叶绿体转录及其在植物生长过程中的作用机制提供了基础。相关研究成果发表在《细胞》(Cell)杂志上。

黄曲霉基因敲除体系的构建及其RNA依赖的RNA聚合酶1基因在生长发育中的作用

目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用。方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重叠PCR(overlap PCR)法融合RDRP1基因上下游片段和嘧啶磺胺抗性基因(ptrA);采用聚乙二醇(PEG)介导方法将该融合片段导入A.flavus的原生质体中获得RDRP1阳性转化子(ptrA抗性),采用Sourthern blot鉴定筛选RDRP1基因突变菌株;对RDRP1基因突变菌株,采用十字交叉法测定生长速率、血细胞计数板统计产孢量,手动计数Wickerham Medium(WKM)+尿嘧啶尿苷(UU)培养基上产生的菌核数量。结果获得ptrA抗性转化子13个;Sourthern blot鉴定4个为RDRP1基因缺失菌株,效率30.8%;与CA14相比,RDRP1基因突变菌株在表型、生长率、产孢量及菌核发育上差异无统计学意义(P>0.05)。结论overlap PCR结合PEG介导转化的方式可短时间内获得A.flavus基因敲除突变菌株,RDRP1基因不参与A.flavus表型、生长率、产孢量及菌核发育的调控作用。

组织RNA聚合酶Ⅲ亚基G表达增加预测肌层浸润性膀胱癌辅助化疗反应和预后不良

目的 研究RNA聚合酶Ⅲ亚基G(POLR3G)在肌层浸润性膀胱癌(MIBC)组织中的表达及其与病人辅助化疗(ACT)反应和预后的关系。方法 2016年3月~2022年1月连续招募42例在我院就诊的MIBC病人,均采用根治性膀胱切除术治疗。使用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析MIBC临床样本中POLR3G的表达,构建组织POLR3G表达与病人临床特征的关系,分析临床结局。结果 临床队列分析发现,MIBC组织POLR3G mRNA高表达与更高的肿瘤分级和pT分期有关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,高POLR3G表达组病人的OS(中位值:9.5个月vs.25.0个月)及PFS(中位值:15.0个月vs.25.0个月)均短于低表达亚组(P<0.05)。组织POLR3G高表达是MIBC病人PFS(P=0.003)和OS(P=0.048)不良的独立预后指标,与接受ACT的POLR3G高表达的pT3/4或N_(+) MIBC病人相比,低POLR3G表达的pT3/4或N_(+) MIBC病人接受ACT后OS显著延长(P<0.001)。结论 POLR3G mRNA表达在MIBC组织中表达上调,可能是MIBC的一个潜在的预后指标,可能是预测局部进展病人辅助化疗选择的一个候选分子标志物。

基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术检测EV-A71 RNA及其与病毒3D聚合酶的相互作用

RNA荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术利用荧光标记的核苷酸探针,通过互补链杂交,对细胞或组织中特定的RNA序列进行检测和定位。由于RNA-FISH产生的阳性信号较弱,需要结合特异性信号放大,提高信噪比。但传统信号放大技术的背景难以消除,无法定量且分辨率低,是RNA-FISH技术应用的巨大障碍。本文基于第3代杂交链反应(hybridization chain reaction version 3.0,HCR v3.0),利用一对分裂式探针消除非特异杂交背景,并引发荧光信号放大反应,建立了针对肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)RNA的敏感、特异的FISH检测方法,并将该技术与蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结合,通过高分辨率激光共聚焦成像,成功地在单个细胞水平上检测了EV-A71感染细胞后病毒RNA与其聚合酶3D蛋白的分布变化和相互作用情况,并对细胞中病毒RNA和3D蛋白进行定量。发现相较于传统定量方法,如逆转录定量聚合酶链反应和免疫印迹,新一代RNA-FISH技术在单个细胞水平上病毒RNA和3D聚合酶的表达情况与群体细胞检测的结果在趋势上有明显差异。这说明,基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术,可以克服群体细胞数量增减掩盖病毒组分变化的缺点,从而真实反映病毒在单个细胞中的变化。

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

RNA依赖的RNA聚合酶的结构特征及其靶向抑制剂的开发

新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸道传染性疾病。自2019年爆发以来,SARS-CoV-2在世界范围内引起大流行,严重威胁人类的生命安全。目前,已有的疫苗尚不能提供完全的机体免疫保护。因此,开发广谱有效的抗病毒抑制剂是当下热门的研究方向。SARS-CoV-2属于RNA病毒,其RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)在不同RNA病毒中具有高度保守性,是抗病毒抑制剂研发的重要靶标。RdRp是RNA病毒复制的核心组成部分,具有典型的右手杯状结构特征。本文重点介绍近年爆发并持续流行的新型冠状病毒RdRp的结构特征,以及靶向抑制剂的研发进展。同时,选取了其它几种有代表性的致病RNA病毒:流感病毒、轮状病毒、人类鼻病毒、丙型肝炎病毒和寨卡病毒,介绍了它们RdRp的结构特征及其靶向抑制剂的开发。本研究比较了抑制剂靶点结构的异同及抑制效果差异,并分析了可能导致该差异的原因。最后,本文总结讨论了目前针对RdRp抑制剂相关研究的瓶颈问题,为未来针对突发性的RNA病毒传染病的抗病毒抑制剂开发提供新思路。

RNA聚合酶动态调控DNA转录的单分子水平研究进展

真核生物的RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)和原核生物的RNA聚合酶(RNAP)主要负责转录合成信使RNA(mRNA),调控不同基因的转录水平,以调节生物体的生长发育和应对复杂多变的环境。研究者采用传统的荧光显微镜观测到RNAP可形成团簇,据此针对DNA转录调控提出“转录工厂”模型。随着单分子技术的发展,研究者在单分子水平上观测到了活细胞中RNAP动态调控DNA转录,提出RNAP可以通过液-液相分离机制进行转录调控。该综述总结了不同单分子荧光显微镜的技术原理,以及相关的荧光探针标记方法,并介绍了在真核生物和原核生物中应用单分子成像技术可视化RNA聚合酶动态调控DNA转录过程的研究进展,最后展望了单分子技术在转录调控研究中的应用前景。

miRNA表达谱在产前诊断胎儿先天性心脏病中的研究

目的:探究微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱在产前诊断胎儿先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)中的应用。方法:收集2021年1月—2022年12月于天津市中心妇产科医院就诊的30例超声确诊为CHD的孕妇(病例组)和同期10例要求行羊水穿刺的孕妇(对照组),用Illumina测序平台对2组孕妇的羊水上清进行全转录组测序,2组孕妇的全部miRNA进行归一化,分析差异表达的miRNA。从差异表达的miRNA中挑选P<0.05和|log2 FC|>3(差异倍数,Fold Change,FC)的miRNA再在羊水和外周血中进行实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)验证,比较羊水中miRNA测序与RT-qPCR的差异倍数,挑选外周血与羊水表达调控方向一致的miRNA。结果:共发现138个差异表达miRNA,其中85个上调,53个下调。进一步挑选出了15个差异表达的miRNA,羊水中miRNA测序与RT-qPCR结果比较相一致。外周血与羊水中表达调控方向一致的miRNA有2个,分别为miR-222-3p和miR-189-5p,这2个miRNA在病例组母血中表达量较对照组显著上升(均P<0.05)。结论:母血中miRNA作为新的血清学标志物可以初步应用于筛查胎儿CHD。

鹿茸多胺对小鼠肝细胞RNA聚合酶活性的影响

多次给小鼠po鹿茸多胺(PASPA)30mg/kg,可明显促进[~3H]leucine和[~3H]uridine掺入肝组织蛋白质和RNA。体外实验证明,鹿茸多胺在较低浓度(1～10μg/ml)时,对RNA聚合酶活性呈明显的增强作用。提示,鹿茸多胺刺激小鼠肝组织蛋白和RNA合成效应是由于其能够明显增强RNA聚合酶活性,尤其是显著增强RNA聚合酶Ⅱ的活性。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对RSV的RNA聚合酶转录活性的影响

目的研究金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对呼吸道合胞病毒(RSV)RNA聚合酶转录活性的作用。方法通过体外分离病毒核糖核蛋白复合体(RNP)进行体外转录,并在转录过程中应用放射性核苷酸标记,同位素检测RSV的mRNA全长转录本,从而观察金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶活性的影响。结果正常细胞组与病毒感染细胞模型组放射性核苷酸辐射强度有显著差异(P<0.01),而白藜芦醇组转录掺入的放射性核苷酸明显低于病毒对照组(P<0.01),而各含药血清组差异不显著。结论金欣口服液有效单体白藜芦醇对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶有较好的抑制作用,其可能是金欣口服液抗RSV的作用机制之一。

互补引物/模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶

构建含有感染性克隆HCV非结构基因 5b区序列的酵母表达质粒 ,转化毕加酵母 ,获得持续、可溶性HCVRNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)的表达 ,纯化蛋白在SDS -PAGE及Westernblot中显示出特异性的 6 4 2kDHCVRdRp蛋白带 ,同聚引物 /模板测定显示RdRp的活性极低 ,延长反应时间 ,RNA聚合活性仅轻度升高。采用合成的杂聚互补引物 /模板 ,未发现核苷酸在毕加酵母表达的RdRp作用下掺入模板 ,随时间延长 ,杂聚互补引物 /模板降解。

荧光定量聚合酶链反应法比较标准管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠不同组织中的表达

背景:反转录聚合酶链反应用于基因表达分析越来越显示出其重要性,其中合适的内参基因选择很重要,目前并没有适合于所有体系可作为内参的管家基因。大鼠是常用动物模型,选择合适的大鼠管家基因作为内参尤其必要。目的:比较分析使用最广泛的4个标准管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠肝、肾、心、肺组织和大脑皮质中的表达情况。设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-07/08在泰山医学院生命科学研究所分子生物学实验室及泰安市疾控中心病毒检测中心实验室完成。材料:选用老年SD大鼠3只,用于检测管家基因表达情况。方法:采用反转录实时荧光聚合酶链反应技术检测老年大鼠肝、肾、心、肺组织和大脑皮质中有着不同表达丰度和功能的4个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA的表达情况。主要观察指标:老年大鼠不同组织内4个管家基因的表达水平及不同组织间的表达差异。结果:①酸性核糖体磷蛋白P0在老年大鼠不同组织间表达差异最小。②老年大鼠肾组织中表达最稳定的管家基因是β-肌动蛋白;心脏组织和肺组织中表达最稳定的管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶。结论:老年大鼠组织间信使RNA分析仅用1个内参基因是不合适的,至少应该使用两个参照基因,1个选用18S核糖体RNA;另一个基因的选择标准如下:适用于分析不同组织间基因表达情况的内参基因是酸性核糖体磷蛋白P0,而心脏和肺组织研究适用3-磷酸甘油醛脱氢酶,肾组织研究适用β-肌动蛋白。

流感病毒RNA聚合酶的分离与纯化(英文)

目的 建立分离、纯化流感病毒RNA聚合酶PB1、PB2和PA 3P蛋白的有效方法 ,为进一步研究 3P蛋白的结构和功能奠定基础。方法 用甘油、CsCl1及CsTFA不同介质的密度梯度超速离心法进行分离 ,用SDS -PAGE电泳及Westernblot法检测 3P蛋白 ,用尿素变性PAGE检测vRNA。结果 用甘油密度梯度离心 ,可从病毒粒子中分离由NP、3P和RNA组成的RNP。将纯化的RNP用CsCl和甘油双组分不连续密度梯度离心 ,可形成NP和 3P -RNA两部分 ,使NP与 3P -RNA分离。进一步将 3P -RNA在CsTFA -甘油双组分不连续密度梯度介质中进行超速离心 ,可有效地将 3P与RNA分离 ,获得较纯的 3P蛋白。 3P位于离心管的上半部分 ,而RNA则位于离心管的近底端部分。结论 用甘油、CsCl-甘油和CsTFA

稳定表达T7RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.

新型冠状病毒亚基因组RNA检测方法的建立及性能评估

目的建立检测新型冠状病毒(新冠病毒)亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)的方法,并对所建立的方法进行性能评估。方法根据新型冠状病毒sgRNA序列设计引物和探针,建立检测sgRNA的实时荧光逆转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,对所建立的方法进行优化,包括引物、探针的浓度及比例、延伸温度、反应体积和模板量。并对所建立的方法进行性能评估,包括最低检测限、灵敏度、特异性和重复性。对临床样本进行新冠病毒sgRNA和基因组RNA(genomic RNA,gRNA)检测,并对检测结果进行分析。结果建立了检测新冠病毒sgRNA的RT-PCR方法。所建方法的最低检测限为100 copies/mL,对常见病原体的检测结果均为阴性。对高、中、低浓度样本sgRNA进行检测,CV均<5%。115例疑似新冠病毒感染者的咽拭子样本sgRNA为阳性(115/330,阳性率为34.85%)。gRNA-N Ct值<30时,sgRNA-N的阳性率为100.00%;gRNA-N的Ct值介于30~32时,sgRNA-N的阳性率为68.75%;gRNA-N的Ct值介于32~35时,sgRNA-N的阳性率为44.44%;gRNA-N的Ct值>35时,sgRNA-N均为阴性。结论建立了新冠病毒sgRNA的RT-PCR检测方法,方法灵敏、特异、重复性好。