老年脓毒症病人RNA损伤与28 d死亡率的相关性研究

目的探讨老年脓毒症病人RNA损伤与28 d死亡率的相关性。方法选取急诊入院的老年脓毒症病人,根据28 d生存情况分为存活组及死亡组,记录年龄、性别、住院时间、平均动脉压,检测RNA氧化损伤后尿中代谢产物8-氧化鸟苷(8-oxoGuo)浓度等临床实验室指标,并评估APACHEⅡ评分和序贯器官衰竭(SOFA)评分,随访病人28 d死亡率。比较存活组和死亡组之间上述指标的差异,分析影响老年脓毒症病人28 d死亡的危险因素。采用ROC曲线分析不同指标对老年脓毒症病人28 d死亡的预测价值。结果8-oxoGuo、APACHEⅡ评分、SOFA评分和去甲肾上腺素(NE)用量是影响老年脓毒症病人28 d死亡的危险因素(P<0.05)。8-oxoGuo对病人预后有较高的预测价值(AUC=0.847,Z=6.397,P<0.001),其预测死亡风险的特异度和灵敏度分别是87.5%和70.8%。结论RNA氧化损伤与老年脓毒症病人的不良预后显著相关。

RNA损伤修复

传统的观念认为RNA损伤修复远不如DNA损伤修复重要 ,然而 ,随着RNA甲基化损伤修复机制及RNA修复酶的发现 ,这一观点受到了巨大的挑战。RNA损伤可以诱导细胞周期阻滞和凋亡 ,RNA修复可能是一种细胞防御机制 ,在细胞损伤应激反应中发挥重要作用 。

LC-MS/MS定量检测小鼠尿液RNA氧化标志物8-oxoGsn

目的建立快速高效的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)用于测定小鼠尿液中RNA氧化标志物8-氧化鸟苷(8-oxoGsn)水平。方法小鼠尿液37℃孵育离心后,用70%甲醇溶液(含30%10 mmol/L醋酸铵)1∶10稀释尿液上清,加入同位素内标[13C,15N2]8-oxoGsn,用Agilent ZORBOX SB-Aq色谱柱(100 mm×3 mm,1.8μm)分离,以含0.1%甲酸的10 mmol/L醋酸铵水溶液及甲醇溶液为流动相梯度洗脱,柱温35℃,流速0.3 mL/min,进样量5μL,电喷雾离子源正离子模式,多反应监测。结果8-oxoGsn响应和水平的线性关系良好,R^(2)为0.996,定量检测限为0.25 ng/mL,加标回收率86.21%~112.56%,基质效应为-5.01%,日内和日间变异系数分别为3.38%~7.17%、2.74%~9.52%,满足生物样品的分析要求;小鼠尿液检测结果显示C57小鼠对乙酰氨基酚(APAP)处理组8-oxoGsn水平明显高于C57对照组(P<0.01);乙型肝炎病毒转基因(HBV-Tg)小鼠APAP处理组8-oxoGsn水平明显高于HBV-Tg小鼠对照组(P<0.001)。结论建立的LC-MS/MS灵敏度高,准确可靠,适用于小鼠尿液中8-oxoGsn水平的测定。

DNA损伤激活的长链非编码RNA促进多发性骨髓瘤细胞增殖及耐药研究

目的:探讨DNA损伤激活的长链非编码RNA(NORAD)对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖及对硼替佐米(BTZ)化疗耐药性的影响。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测健康人和骨髓瘤患者、不同MM细胞系中NORAD表达差异,并分析其与MM患者生存率关系;运用慢病毒转染技术,干扰细胞系中NORAD的表达,检测其表达差异;定量PCR(qPCR)检测骨髓瘤细胞系中人类非编码RNA-144a-3p(hsa-miR-144a-3p)的表达;采用双荧光酶素报告验证NORAD和hsa-miR-144a-3p的结合;通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验进一步验证LncRNA和miRNA的结合;细胞计数试剂8(CCK8)法检测各细胞处理后细胞活性。细胞克隆试验检测细胞增殖能力。结果:MM患者细胞系中NORAD常高表达,提示预后差,生存期短;敲除NORAD基因后,MM耐药细胞系对BTZ药物敏感性增加。MM患者hsa-miR-144a-3p高表达,在骨髓瘤细胞系中加用miR-144a-3p类似物时细胞增殖能力下降;NORAD低表达可显著抑制细胞增殖,细胞对药物敏感性增强。细胞克隆形成实验也证实NORAD低表达可抑制癌细胞增殖。结论:NORAD高表达可增强MM对BTZ化疗耐药性,NORAD可直接与hsa-miR-144a-3p结合,上调其在MM细胞中的表达,进一步调控癌细胞增殖,同时调控患者对BTZ药物敏感性。

DNA损伤诱导的长链非编码RNA(DINO)下调MMP2表达抑制人绒毛膜滋养层细胞侵袭与迁移

目的探讨DNA损伤诱导的长链非编码RNA(DINO)通过调控迁移相关因子基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达对人绒毛膜滋养层细胞侵袭与迁移的影响。方法收集子痫前期(PE)患者和正常孕妇的胎盘组织(对照组)各20例,Masson染色观察胎盘组织结构改变,免疫荧光组织化学染色检测胎盘组织滋养层细胞MMP2的表达;实时荧光定量PCR检测DINO的表达;将HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞转染DINO小干扰片段(si-DINO)后,实时荧光定量PCR验证DINO、MMP2 mRNA表达,Western blot法检测MMP2蛋白表达;Transwell^(TM)侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭、迁移情况。结果与对照组相比,PE患者血压、蛋白尿水平明显增高;胎盘组织可见纤维素样坏死,绒毛膜绒毛减少;免疫荧光显示胎盘滋养层细胞MMP2表达减弱、DINO表达增加;转染si-DINO后,DINO表达降低,而MMP2 mRNA及蛋白表达增加,HTR-8/SVneo细胞侵袭和迁移能力显著增加。结论DINO下调MMP2表达,抑制胎盘滋养层细胞的侵袭与迁移。

下调DNA损伤激活的长链非编码RNA抗心房颤动大鼠心肌纤维化的机制研究

目的:探究下调DNA损伤激活的长链非编码RNA(lncRNA NORAD)抗心房颤动(房颤)大鼠心肌纤维化作用及可能的作用机制。方法:SD大鼠随机分为对照组、房颤组、重组腺相关病毒血清型9阴性对照(rAAV9-NC)组、重组腺相关病毒血清型9载体含用于沉默lncRNA NORAD的小干扰RNA(rAAV9-siNORAD)组、p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB203580组、rAAV9-siNORAD+SB203580组,每组8只。建立各组模型大鼠并进行对应干预措施,实验结束后对大鼠进行心电图测试,记录房颤的发生率和持续时间;并检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;Masson染色检测心房组织纤维化,计算心房胶原容积分数(CVF);实时荧光定量PCR检测心房组织lncRNA NORAD、Ⅰ型胶原(COL1-A1)和Ⅲ型胶原(COL3-A1)的mRNA表达情况;Western blot检测心房组织丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)、p38MAPK和核因子κB p65(NF-κB p65)及其磷酸化蛋白的表达情况。结果:与对照组相比,房颤组大鼠可观察到P波消失,出现大小不等、不规则的f波,心房组织有明显的纤维化改变,CVF、血清c TnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平、心房组织COL1-A1和COL3-A1的mRNA水平以及lncRNA NORAD表达水平、MKK6蛋白水平、磷酸化p38 MAPK与p38 MAPK的比值和磷酸化NF-κB p65与NF-κB p65比值升高,差异具有统计学意义(P均<0.05);与房颤组相比,rAAV9-siNORAD组和SB203580组大鼠房颤的发生率降低,持续时间缩短(P<0.05),CVF,血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心房组织COL1-A1和COL3-A1的mRNA水平以及lncRNA NORAD表达水平、MKK6蛋白水平、磷酸化p38 MAPK与p38 MAPK的比值及磷酸化NF-κB p65与NF-κB p65的比值降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05);分别与单用SB203580和r AAV9-siNORAD相比,两者联合应用后p38 MAPK/NF-κB p65信号通路的激活被进一步抑制,心肌纤维化程度进一步降低。结论:下调lncRNA NORAD可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB p65信号通路激活对房颤大鼠发挥抗心肌纤维化作用。

甲醛对CHL细胞DNA和RNA合成影响的体外实验研究

目的 研究甲醛对中国仓鼠肺细胞 (CHL细胞 )DNA和RNA的损伤作用 ,探讨甲醛遗传毒性的分子机制。方法 CHL细胞分别暴露于浓度为 75 ,15 0 ,30 0 ,6 0 0 μmol/L的甲醛中 1,2 ,4h ,采用3 H-胸腺嘧啶 (3 H TdR)、 14 C -尿嘧啶 (14 C UR)掺入技术 ,检测甲醛对CHL细胞的DNA和RNA合成的影响。结果 所有 4个浓度组甲醛均明显影响CHL细胞DNA和RNA的合成 ,3 H TdR和14 C UR掺入计数dpm值显著低于对照组 (P <0 0 1) ,并有明显的剂量 -反应关系 (P <0 0 1)。CHL细胞暴露在甲醛中 4h ,各浓度组3 H TdR和14 C UR掺入dpm值显著低于暴露于 1h和 2h的各浓度组 (P <0 0 1)。结论 甲醛可以影响CHL细胞DNA和RNA合成 ,这对进一步研究甲醛遗传毒性的分子机制有重要意义。

甲醛对V79细胞DNA、RNA合成影响的体外实验研究

目的 研究甲醛对V79细胞DNA和RNA的损伤作用 ,探讨甲醛遗传毒性的分子机制。方法 中国仓鼠肺细胞 (V79)分别暴露于浓度为 75 ,15 0 ,30 0 ,6 0 0 μmol/L的甲醛中 ,1h、2h、4h ,采用3 H -胸腺嘧啶核苷 ( 3 H -TdR)、14 C -尿嘧啶核苷 ( 14 C UR)掺入技术检测甲醛致V79细胞DNA和RNA损伤情况。结果 所有 4个浓度组甲醛均明显影响细胞DNA和RNA的合成 ,3 H TdR和14 C UR掺入计数每分衰变数 (dpm值 )显著低于对照组 (P <0 .0 1) ,并有明显的剂量 -效应关系 (P <0 .0 1)。细胞暴露在甲醛中 4h ,各浓度组3 H TdR和14 C UR掺入dpm值显著低于暴露于 1h和 2h各浓度组的dpm值 (P <0 .0 1)。 结论 甲醛可以影响V79细胞DNA和RNA合成 。

长链非编码RNA NORAD在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖能力的影响

目的研究长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(NORAD)在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖的影响。方法RNA-seq分析肺癌组织中LncRNA及miRNA的表达改变,根据表达量确定候选LncRNA;q RT-PCR检测分析肺癌组织及肺癌细胞中候选NORAD的表达;免疫荧光检测分析肺癌组织中细胞增殖核抗原Ki-67的表达;通过线性回归分析肺癌组织中NORAD与Ki-67的表达相关性。生物在线软件联合miRNA测序结果,并通过荧光素酶检测分析NORAD与miR-26b-5p、miR-654-5p结合情况。将A549细胞分成空白对照组(Control)、si-NORAD组、miR-26b-5p mimics、miR-654-5p mimics、si-NORAD与miR-26b-5p mimics联合组、si-NORAD与miR-654-5p mimics联合组,利用EdU检测细胞增殖能力、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡、蛋白印迹(Western blot)检测细胞凋亡相关蛋白(Bad、Bcl-2、Cleaved Caspase-3)的表达。结果NORAD在肺癌组织及肺癌细胞中的表达均显著升高(均P<0.01),其表达量与Ki-67的表达呈正相关(r=0.646,P<0.01)。miR-26b-5p、miR-654-5p在肺癌组织及细胞中的表达均显著降低(均P<0.01),生物在线软件及荧光素酶检测验证,NORAD与miR-26b-5p、miR-654-5p存在结合位点;在肺癌组织中,miR-26b-5p(r=-0.403,P=0.000)、miR-654-5p(r=-0.423,P=0.000)的表达与Ki-67的表达均呈负相关;miR-26b-5p(r=-0.435,P<0.05)与miR-654-5p(r=-0.395,P<0.05)的表达与NORAD表达均呈负相关。与Control组比较,si-NORAD可显著抑制A549细胞的增殖(P<0.01)、促进其凋亡(P<0.01),Bad及Cleaved caspase-3的表达均显著升高(均P<0.01),Bcl-2的表达显著降低(P<0.05);与si-NORAD组比较,si-NORAD与miR-26b-5p mimics联合组、si-NORAD与miR-654-5p mimics联合组可进一步抑制细胞增殖(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.01)。结论肺癌中NORAD的表达显著上调,可能通过抑制mi R-26b-5p、mi R-654-5p的表达而促进肺癌细胞增殖,NORAD可能作为肺癌的诊断标志物。

RNA修复研究进展

机体DNA损伤修复的机制目前已研究得比较全面,而RNA损伤修复的研究却没有引起广泛的认识.主要由于人们长期以来认为损伤的RNA会被机体特异性降解而不是修复.近年来,随着多个RNA损伤修复系统的相继发现,揭示机体对损伤RNA可能优先选择进行修复.本文从噬菌体型RNA修复系统、细菌型RNA修复系统、酵母型RNA修复系统和人类的RNA损伤修复系统四个方面对目前RNA损伤修复研究的最新进展做一综述.

长链非编码RNA PANDAR在非小细胞肺癌中的表达和临床意义

背景与目的:长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤的发生、发展过程中有重要作用。LncRNA CDKN1A反义链启动子DNA损伤激动RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA,PANDAR)与多种肿瘤的进展及预后相关。探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中lnc RNA PANDAR的表达及临床意义。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)方法检测94例新鲜NSCLC组织标本及相对应的癌旁组织标本中PANDAR的表达,分析其与NSCLC的临床病理特征、诊断价值和预后的关系。结果:PANDAR在NSCLC组织中的表达显著低于癌旁组织(P<0.001);PANDAR低表达和高表达组在肿瘤体积、淋巴结转移、疾病分期和分化程度方面差异均有统计学意义(χ~2=9.197,P=0.002;χ~2=7.1 2 6,P=0.0 0 8;χ~2=6.2 7 1,P=0.0 1 2;χ~2=8.1 4 7,P=0.0 0 4);受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.797(95%CI:0.614~0.849;P<0.001),灵敏度和特异度分别是49.8%和84.3%,Youden指数为0.402;PANDAR低表达和高表达组在总生存期(overall survival,OS)及无进展生存期(progression free survival,PFS)上的差异有统计学意义(χ~2=7.282,P=0.007;χ~2=6.777,P=0.009)。结论:PANDAR在NSCLC中低表达,可以作为NSCLC的新型生物标志物和诊断靶标。

长链非编码RNA PANDAR促进结直肠癌转移的作用和机制研究

背景与目的:越来越多的研究表明,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在肿瘤发生、发展过程中有重要作用。Lnc RNA CDKN1A反义链启动子DNA损伤激动RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA,PANDAR)与多种肿瘤的进展及预后相关,在结直肠癌转移中的作用尚未得到证实。该研究旨在探索lnc RNA PANDAR在结直肠癌中的功能,并对其作用机制进行初步探索。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测lnc RNA PANDAR在结直肠癌细胞及组织中的表达,并分析其表达水平与结直肠癌临床病理特征的关系。构建lnc RNA PANDAR沉默(HCT116-sh PANDAR)和高表达(DLD1-PANDAR)及其对照(HCT116-sh NC、DLD1-vector)稳定转染细胞系。通过Transwell和Matrigel实验检测lnc RNA PANDAR对细胞迁移和侵袭能力的影响。采用RTFQ-PCR检测lnc RNA PANDAR表达改变后介导细胞上皮-间质转化能力的主要调控基因表达情况,并对目的基因在介导lnc RNA PANDAR调控结直肠癌细胞转移中的作用进行验证。结果:Lnc RNA PANDAR在结直肠癌细胞中的表达明显高于结直肠正常上皮细胞;Lnc RNA PANDAR在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织[(171.52±97.80)%vs(100.00±63.18)%,P<0.05],且其表达水平与结直肠癌的TNM分期、淋巴结转移和远处转移相关(P<0.05)。在Transwell及Matrigel实验中,lnc RNA PANDAR沉默能够明显减弱结直肠癌细胞的迁移[100.00%vs(42.08±4.77)%,P<0.05]和侵袭[100.00%vs(39.14±3.81)%,P<0.05]能力,lnc RNA PANDAR高表达能够明显促进结直肠癌细胞的迁移[100.00%vs(194.12±9.33)%,P<0.05]和侵袭[100.00%vs(204.08±12.27)%,P<0.05]能力。采用RTFQ-PCR检测lnc RNA PANDAR表达改变后介导结直肠癌细胞上皮-间质转化的基因表达情况发现,锌指E-盒结合同源异形盒(zinc-finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)表达与lnc RNA PANDAR表达呈显著正相关;在lnc RNA PANDAR高表达的细胞中干扰ZEB1表达能够明显逆转lnc RNA PANDAR高表达引起的细胞迁移和侵袭能力的增强。结论:Lnc RNA PANDAR能够通过调控ZEB1表达进而促进结直肠癌转移,lnc RNA PANDAR可能成为结直肠癌新的诊断指标及治疗靶点。

lncRNA NORAD促进食管鳞状细胞癌EC9706细胞的增殖和迁移

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)DNA损伤激活的非编码RNA(non-coding RNA-activated by DNA damage,NORAD)对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞株EC9706增殖和迁移能力的影响及其机制。方法:采用RT-PCR法检测不同ESCC细胞(EC9706、TE1、YES-2、KYSE150)中NORAD m RNA表达水平,通过RNA干扰技术将NORAD的小干扰RNA(siRNA)转染到EC9706细胞(si-NORAD组)以建立NORAD低表达细胞,另设置空白对照组(Ctrl组,不转染任何序列)及阴性对照组(NC组,转染siRNA阴性对照序列),qPCR验证其转染效果。用MTT、平板克隆形成和划痕愈合实验检测敲低NORAD前后EC9706细胞增殖和迁移能力的变化,Western blotting检测敲低NORAD前后EC9706细胞中上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)和锌指转录因子Snail的表达变化。结果:在4种ESCC细胞中NORAD mRNA均呈高表达状态,同时与TE1、YES-2、KYSE150细胞相比,EC9706细胞中NORAD mRNA呈显著高表达(P<0.01)。与Ctrl组和NC组比较,转染NORAD-siRNA后,si-NORAD组EC9706细胞中NORAD表达水平显著降低(均P<0.01),EC9706细胞的增殖和迁移能力显著降低(均P<0.05);敲低NORAD表达后,EC9706细胞中E-cadherin表达升高而N-cadherin和Snail表达降低(均P<0.05)。结论:NORAD在EC9706细胞中呈高表达状态,敲低NORAD表达可通过上调E-cadherin、下调N-cadherin和Snail表达而抑制EC9706细胞的增殖和迁移能力。

lncRNA-NORAD表达对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响及其机制

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA)-DNA损伤诱导的非编码RNA(NORAD)在食管癌Eca-109细胞中的表达,分析沉默NORAD通过miR-26a-5p/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响。方法:收集45例食管癌患者癌组织和40例癌旁正常组织标本,培养正常人食管鳞状上皮Het-1A细胞和食管癌Eca-109细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测癌组织、癌旁正常组织、Het-1A细胞和Eca-109细胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA表达水平。采用miRanda数据库检测NORAD与miR-26a-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测NORAD与miR-26a-5p的关系。根据实验目的和转染质粒的不同,Eca-109细胞分为siRNA NC组和NORAD siRNA组,inhibitor NC组和miR-26a-5p inhibitor组,pcDNA-3.1(+)+mimics NC组、pcDNA-NORAD+mimics NC组、pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平。采用TargetScan数据库检测miR-26a-5p与ULK1的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测miR-26a-5p与ULK1的关系。Eca-109细胞分为siRNA NC组和ULK1 siRNA组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。Eca-109细胞分为siRNA NC+inhibitor NC组、NORAD siRNA+inhibitor NC组、siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组,采用RT-qPCR和Western blotting法检测各组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平。结果:与癌旁组织或Het-1A细胞比较,食管癌组织或Eca-109细胞中NORAD和ULK1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),miR-26a-5p表达水平明显降低(P<0.01)。与siRNA NC组比较,NORAD siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。miRcode数据库和双荧光素酶报告基因检测,NORAD靶向miR-26a-5p。与inhibitor NC组比较,miR-26a-5p inhibitor组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组比较,pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。TargetScan数据库和双荧光素酶报告基因检测,miR-26a-5p靶向ULK1。与siRNA NC组比较,ULK1 siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组比较,NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:沉默lncRNA-NORAD可抑制Eca-109细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化(EMT),其机制可能是通过调控miR-26a-5p/ULK1轴实现的。

lncRNA DINO在同型半胱氨酸致内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨DNA损伤诱导的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)DINO在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)致内皮细胞凋亡中的作用。方法以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,MTT法检测不同浓度的Hcy对内皮细胞增殖的影响,筛选合适浓度;最适浓度Hcy干预细胞后分为对照组(0μmol·L^(-1) Hcy)和实验组(100μmol·L^(-1) Hcy),用细胞活力染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA DINO的表达;细胞活力染色、流式细胞术、蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测Hcy作用于转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs细胞的凋亡情况及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果100μmol·L^(-1) Hcy对内皮细胞的增殖有抑制作用(P<0.001);与对照组相比,实验组细胞凋亡数增加,且lncRNA DINO表达增加(P均<0.01);转染干扰片段si-DINO、lncRNA DINO表达下降(P<0.01);Hcy作用于转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs细胞的凋亡数下降,Bax/Bcl-2比值下降(P均<0.01)。结论lncRNA DINO能够促进Hcy诱导的内皮细胞凋亡。

NORAD在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织及口腔鳞癌细胞系中的表达及作用机制

目的探讨DNA损伤激活的非编码RNA(NORAD)在口腔鳞状细胞癌组织,癌旁组织及口腔鳞癌细胞系中的表达及作用。方法回顾性选取2020年1月至2022年1月在河北医科大学第四医院行手术切除的口腔鳞状细胞癌组织标本88例,同时选取癌旁组织标本88例作为对照。采用PCR检测组织中NORAD mRNA相对表达量,分析不同临床病理特征口腔鳞状细胞癌组织NORAD mRNA相对表达量差异;同时选取口腔鳞癌细胞系SCC9、CAL27、SCC15及TSCCA细胞,以及正常黏膜HOK细胞,检测各细胞NORAD mRNA相对表达量差异。结果口腔鳞状细胞癌组织NORAD mRNA相对表达量为2.21±0.87,明显高于癌旁组织(1.03±0.34),差异有统计学意义(P<0.05)。TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移口腔鳞状细胞癌组织NORAD mRNA相对表达量分别为2.79±0.69、2.62±0.65、2.68±0.68,明显高于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移口腔鳞状细胞癌组织(1.98±0.67、2.03±0.70、1.93±0.62),差异均有统计学意义(P<0.05);复发和未复发患者NORAD mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CAL27细胞NORAD mRNA相对表达量为1.87±0.41,明显高于SCC15、SCC9、TSCCA、HOK细胞(1.40±0.44、1.39±0.46、1.06±0.34和0.51±0.18),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NORAD在口腔鳞状细胞癌组织表达上调,与TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关,NORAD在CAL27细胞中表达最高。

冠心病患者尿8-oxo-Gsn水平及其临床意义

目的分析RNA氧化损伤标志物尿8-oxo-Gsn与冠心病类型、冠脉病变支数的关系。方法选择以胸痛入院的患者422例。将所有患者分为非冠心病组(C)和冠心病组,并根据冠心病组患者的临床特点将其分为三个亚组:稳定型心绞痛组(SA),不稳定型心绞痛组(UA)及急性心肌梗死组(MI);根据冠状动脉病变支数将冠心病组患者分为三个亚组:单支病变(S)、双支病变(D)和三支病变组(T)。收集所有入组患者在接受造影前的清洁尿标本,采用同位素稀释高效液相-串联质谱法(ID-LC-MS/MS)检测尿8-oxo-Gsn,并用尿肌酐浓度予以校正。应用SPSS 19.0进行统计分析,比较不同组间尿8-oxo-Gsn的差异及各组患者尿8-oxo-Gsn阳性率的差异。结果 C与SA、UA、MI组的尿8-oxo-Gsn(单位μmol/mol creatinine)的平均值分别为(2.875±0.609)、(3.285±1.031)、(3.433±1.175)、(4.224±1.557),不同类型冠心病组尿8-oxo-Gsn水平的差异有统计学意义(P<0.01),每两组间差异有统计学意义(均为P<0.05);S、D和T组患者的尿8-oxo-Gsn(单位μmol/mol creatinine)的平均值分别为(3.458±1.261)、(3.464±1.121)、(3.640±1.339),不同病变支数组尿8-oxo-Gsn水平的差异有统计学意义(P<0.01),每两组间差异无统计学意义(均为P>0.05);尿8-oxo-Gsn阳性率在健康人及不同类型冠心病患者中的差异有统计学意义(P<0.01)。结论冠心病患者尿8-oxo-Gsn水平和阳性率较非冠心病者明显升高;尿8-oxo-Gsn在不同冠脉病支数患者中的变化不显著。尿8-oxo-Gsn或可作为一种潜在的生物标志物指示冠心病患者体内氧化应激水平的升高。

DNA损伤诱导的非编码RNA在甲状腺乳头状癌上皮间充质转化中的作用

目的探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)组织、癌旁正常组织中DNA损伤诱导的非编码RNA(non-coding RNA activated by DNA damage, NORAD)表达差异,及下调TPC-1细胞NORAD表达对上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响。方法取106例PTC患者手术切除PTC组织及癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测NORAD表达,分析NORAD阳性表达与PTC临床病理特征的关系。取对数生长期TPC-1细胞,分为转染组(转染siRNA-NORAD)、阴性对照组(转染siRNA-NC)和空白对照组(不作任何处理),转染后培养48 h,免疫荧光法观察TPC-1细胞形态改变,采用实时荧光定量PCR法检测NORAD表达,采用Transwell法检测TPC-1细胞迁移、侵袭能力,采用Western blot法检测E-cadherin和vimentin表达。结果 PTC组织NORAD mRNA相对表达量(2.73±0.17)高于癌旁正常组织(1.17±0.12)(P<0.05);NORAD阳性表达率在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(59.68%)、有颈淋巴结转移(59.38%)、有包膜侵犯者(64.86%)高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(36.36%)、无颈淋巴结转移(35.71%)、无包膜侵犯者(42.03%)(P<0.05);转染后培养48 h,阴性对照组、空白对照组细胞多呈梭形、结构较为松散,转染组细胞呈星形,向四周伸展、排列紧密;转染后培养48 h,转染组NORAD mRNA相对表达量(0.54±0.08)较空白对照组(1.84±0.06)和阴性对照组(1.79±0.07)低(P<0.05),迁移细胞数目[(47.08±7.11)个]、侵袭细胞数目[(23.14±6.23)个]较空白对照组[(94.15±9.42)、(44.68±10.04)个]和阴性对照组[(92.73±10.01)、(52.95±8.09)个]少(P<0.05),vimentin相对表达量(0.21±0.05)低于阴性对照组(0.51±0.06)和空白对照组(0.55±0.07),E-cadherin相对表达量(0.94±0.12)高于阴性对照组(0.34±0.08)、空白对照组(0.31±0.06)(P<0.05),空白对照组各指标与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PTC组织NORAD呈高表达,且表达水平与肿瘤恶性程度有关;下调TPC-1细胞NORAD表达可抑制细胞侵袭、迁移,其机制可能与抑制EMT有关。

NORAD在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制

目的探讨DNA损伤激活的非编码RNA(NORAD)在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法根据培养基中葡萄糖浓度将小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES-13分为高糖组及低糖组,处理24 h后转染NORAD小干扰RNA(si-NORAD)及Toll样受体4(TLR4)小干扰RNA(si-TLR4),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NORAD及TLR4的表达。在SV40-MES-13细胞中分别转染NORAD、TLR4过表达质粒及小干扰RNA。Cell Counting Kit-8(CCK-8)、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡结果;共转染NORAD和miR-520h模拟剂,TLR4和miR-520h模拟剂后检测荧光素酶强度及三者表达情况;共转染si-NORAD和miR-520h抑制剂、TLR4过表达质粒和miR-520h模拟物以及共转染si-TLR4和miR-520h抑制剂后检测三者水平及细胞增殖水平来验证三者的调节关系。结果高糖处理小鼠系膜细胞SV40-MES-13后,NORAD(1.65±0.08比1.00±0.06,P=0.003)及TLR4(1.96±0.09比1.01±0.07,P=0.001)的表达均升高。NORAD及TLR4过表达后细胞增殖加快(1.34±0.04比0.85±0.04,P=0.001;1.33±0.02比0.82±0.03,P<0.001),细胞凋亡减少(0.45±0.03比0.94±0.06,P=0.001;0.51±0.05比0.99±0.03,P=0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-520h能与NORAD及TLR4结合;NORAD与miR-520h表达相互影响,miR-520h模拟物可减少TLR4表达。与单独转染si-NORAD相比,共转染si-NORAD及miR-520h抑制剂时TLR4相对表达量升高(0.74±0.03比0.55±0.03,P=0.014);与单独转染miR-520h模拟物相比,共转染miR-520h模拟剂及TLR4过表达质粒后细胞增殖更快(0.73±0.01比0.61±0.02,P=0.007);与单独转染miR-520h抑制剂相比,共转染miR-520h抑制剂及si-TLR4后细胞增殖减少(1.31±0.04比1.55±0.04,P=0.013)。结论NORAD可结合miR-520h调节TLR4促进高糖诱导系膜细胞增殖及抑制凋亡。