玉米端粒酶RNA模板基因候选序列的转基因鉴定体系研究

研究采用pCAMBIA 1301穿梭质粒和LBA 4404菌株,侵染不同品种玉米成熟胚诱导的愈伤组织,以构建玉米端粒酶RNA候选序列的转基因鉴定体系。构建了两个含有玉米端粒酶RNA的pCAMBIA 1301穿梭质粒,一个携带模板区正常的玉米端粒酶RNA候选序列(野生型),另一个携带模板区定点突变处理的端粒酶RNA候选序列(突变型),然后分别侵染甜玉米成熟胚诱导的愈伤组织,也同样分别侵染糯玉米成熟胚诱导的愈伤组织。结果表明:在愈伤组织培养中,甜玉米的愈伤诱导率在40%左右,而糯玉米的愈伤诱导率高达80%;在抗性筛选培养基上已成功获得抗性愈伤组织,经PCR鉴定愈伤组织基因组中分别含有正常和突变的目的片段,这表明成功构建了玉米端粒酶RNA候选序列的转基因鉴定体系,为进一步鉴定相关候选序列提供有效的技术方法。

多药耐药基因QRT-PCR检测中内标准DNA和RNA模板的构建

利用多药耐药基因(MDR1)全基因质粒和分子克隆技术,经二次克隆将戊型肝炎病毒一段238bP的核苷酸序列插入MDR1 308 bp的目的 cDNA片段,构建了插入突变型MDR1-cDNA重组体作为定量PCR的DNA竞争模板;再经第三次克隆构建了插入突变型MDR1-RNA重组体,最后经体外转录出546 nt的正链RNA作为逆转录的RNA竞争模板。所建立的定量逆转录-多聚酶链反应(QRT-PCR)技术简便、快速、灵敏,可检出1fg水平的MDR1 mRNA,为临床MDR1表达的定量检测提供了确实可行的手段。

MRP基因定量RT-PCR内标准DNA模板和RNA模板的构建

目的：构建定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）的内标准ＤＮＡ模板和ＲＮＡ模板，定量检测多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）基因表达的ｍＲＮＡ。方法和结果：利用现有的ＭＲＰ全基因质粒和分子克隆技术经２次克隆将庚型肝炎病毒的一段２３８ｂｐ的核苷酸序列插入ＭＲＰ２９２ｂｐ的目的ｃＤＮＡ片段，构建了插入突变型ＭＲＰｃＤＮＡ重组体作为定量ＰＣＲ的ＤＮＡ竞争模板；再经第３次克隆构建了插入突变型ＭＲＰＲＮＡ重组体，最后经体外转录出５３０ｎｔ的正链ＲＮＡ作为逆转录的ＲＮＡ竞争模板。结论：所建立的ＲＴＰＣＲ技术简便、快速、灵敏，可检出１ｆｇ水平的ｍＲＮＡ量。用ＤＮＡ竞争模板定量检测比用ＲＮＡ竞争模板更简便、经济、可靠。

端粒酶RNA亚基模板突变抑制HeLa肿瘤细胞的生长

在端粒酶阳性的肿瘤细胞中引入带突变模板的人端粒酶RNA亚基(MT-hTR)是一种新颖的抑制肿瘤细胞生长的方法.本研究通过构建MT-hTR真核表达重组体,初步观察其对人宫颈癌HeLa细胞生长的影响.通过分子克隆技术及PCR介导的定点突变技术构建野生型及突变型hTR表达重组体,将空载体及重组体分别与质粒pEGFP-C1通过脂质体共转染HeLa细胞,经药物G418的筛选得到稳定表达外源基因的细胞.RT-PCR检测目的基因的表达,TRAP分析细胞的端粒酶活性,并通过MTT法绘制各组细胞的生长曲线.结果发现,重组体在细胞内能成功表达目的基因,并且在Mutant1转染细胞中检测到相应的突变型端粒酶活性.构建的4个MT-hTR重组体中,有3个能使HeLa细胞生长速度减缓.以上结果提示,在HeLa细胞内表达MT-hTR能抑制细胞的生长速度,并且突变模板的设计可能会影响到抑制效应的发挥.

利用RNA干扰抑制CXCR4基因表达对乳腺癌细胞转移和侵袭能力的影响

目的探讨抑制趋化因子受体CXCR4基因对乳腺癌细胞转移和侵袭能力的影响。方法将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231分为未干扰组、CXCR4干扰组、β-actin干扰组和空白载体干扰组。设计并合成了针对CXCR4基因的发夹式siRNA模板,体外合成siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs),经脂质体转染CXCR4干扰组细胞,采用Western blot免疫印迹法和逆转录聚合酶链反应检测各组的抑制效果,用Biocoat Matrigel侵袭能力检测仪检测MDA-MB-231细胞的转移侵袭能力。结果SECs在mRNA水平和蛋白水平均明显抑制CXCR4基因的表达。CXCR4表达被抑制后,癌细胞侵袭能力受到明显抑制,与未干扰组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论SECs可以高效特异地抑制人乳腺癌细胞中CX-CR4基因的表达。CXCR4基因高表达与乳腺癌细胞的转移密切相关,抑制细胞中CXCR4的表达可以抑制乳腺癌细胞转移和侵袭能力。图2参13。

脂质体介导反义hTR基因转染对腺样囊性癌细胞系SAcc83的影响

目的 检测SAcc83细胞系端粒酶活性并观察人端粒酶模板hTR封闭后细胞生长行为的改变及与凋亡的关系。方法TRAP-PCR-ELISA法检测SAcc83细胞系端粒酶活性,脂质体介导真核表达载体PBBS212-ahTR转染SAcc83,PCNA免疫组化染色以证实其增殖活性改变,TUNEL法及琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果转染反义hTR后SAcc83细胞增殖能力明显下降,群体倍增时间延长,转染细胞约30天后死亡。各项凋亡检测均证明细胞凋亡的存在。结论hTR反义基因通过封闭端粒酶模板RNA抑制了端粒酶活性,并可能通过某种途径激活细胞的凋亡程序,这为以端粒酶为靶子治疗恶性肿瘤提供了方向。

稳定表达反义hTR抑制人胰腺癌细胞生长(英文)

目的 为探讨抑制人端粒酶的模板RNA成分 (hTR)能否抑制人胰腺癌细胞的端粒酶活性及细胞生长能力。方法 用分子克隆方法将 5 93bp的hTR全长cDNA反向亚克隆到哺乳细胞表达载体pcDNA3 1( )的多克隆位点上 ,以构建hTR反义表达质粒。酶切及序列分析证实此质粒为hTR反义表达质粒。此重组表达质粒与空质粒一起 ,通过脂质体法转导到人胰腺癌panc1细胞 ,并用G4 18筛选抗性克隆 ,所产生的稳定生长克隆用位于pcDNA3 1多克隆位点两侧的T7及GBH引物进行PCR扩增以证实外源hTR的存在。最后 ,对这些细胞的生长曲线、内源性hTR的表达、端粒酶活性及锚着非依赖性生长特性进行了分析。结果 转导有反义hTR重组质粒的人胰腺癌细胞与转导空载体及未转导任何质粒的对照细胞相比 ,NorthernBlot及RT PCR方法证实其内源性hTR的表达明显下调 ,TRAP方法证实其端粒酶活性明显下降。而且 ,其细胞增殖速度和软琼脂集落形成能力亦较对照组细胞明显减慢。但没有观察到明显的细胞衰老或调亡现象。结论 上述结果表明hTR是人端粒酶复合物的关键组成部分 。