冬凌草甲素对HepG2细胞内质网应激蛋白IRE-1、PERK和CHOP的作用研究

目的研究内质网应激对冬凌草甲素处理的肝癌细胞HepG2的作用。方法采用特异性小干扰RNA(siRNA)转染HepG2细胞72 h抑制内质网应激蛋白RNA激活蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、抑制物阻抗性酯酶1(IRE-1)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达后,MTT法观察40μmol·L-1冬凌草甲素处理12h的转染细胞的细胞存活率。结果 PERK和IRE-1 siRNA转染抑制相应蛋白表达后增加冬凌草甲素诱导的HepG2细胞死亡(P<0.05);而抑制CHOP表达对冬凌草甲素处理的HepG2细胞存活率没有影响(P>0.05)。结论冬凌草甲素诱导的内质网应激对HepG2细胞具有保护作用。

利用蛋白导入法沉默线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达

目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Motif1)与细胞穿膜多肽TAT融合构建3TAT-RBD,并通过原核表达体系进行目的蛋白的表达和纯化。获取重组3TATRBD蛋白后,利用非变性胶电泳检测3TAT-RBD与荧光标示Cy3-dsRNA的结合能力。利用蛋白导入法和荧光显微镜观察3TAT-RBD将Cy3-dsRNA导入胶质瘤细胞的效率。在细胞水平检测和比较3TAT-RBD和Lipofectimine 2000将Cy3-dsRNA导入细胞的效率以及对沉默线粒体分裂蛋白动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)的效果。结果:通过原核表达体系获得3TAT-RBD重组蛋白,体外结合实验证实3TAT-RBD与双链dsRNA具有良好的结合能力。荧光显微镜观察也发现3TAT-RBD与Lipofectimine 2000均能将Cy3-dsRNA导入gli36胶质细胞。在RNA干扰实验中发现,3TAT-RBD和Lipofectimine2000均能有效地抑制Drp1的表达,Lipo+siRNA和3TAT-RBD+siRNA组Drp1的表达水平分别为对照组的36%和42%。结论:本研究中构建的3TAT-RBD利用了细胞穿膜多肽和RBD与dsRNA结合特性,有效地将siRNA导入细胞进行基因沉默实验,这将为今后RNA干扰实验提供新的工具。

油茶皂苷通过内质网应激途径诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的研究

目的探讨油茶皂苷诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用及其作用机制。方法采用MTT法考察了油茶皂苷对肿瘤细胞增殖的影响;用Western blot方法分析油茶皂苷对caspase-3、PARP、Bip、ATF6、IRE1、Perk、eIF2a和eEF2蛋白质表达的影响。结果油茶皂苷(10～30 mg.L-1)明显抑制HepG2细胞的增殖。同时可激活Caspase信号通路,诱发PARP底物的断裂;进一步上调IRE1表达量及活化Perk、eIF2a和eEF2蛋白。结论油茶皂苷通过内质网应激途径诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡。

变异型EBER2通过抑制PKR通路增强鼻咽癌细胞抗凋亡能力

目的:前期研究发现变异型EB病毒编码小RNA 2(EBER2)基因EB-8m可能与鼻咽癌(NPC)相关,本研究旨在探讨变异型EBER2是否通过增强对RNA激活蛋白激酶(PKR)的抑制作用从而提高NPC细胞的抗凋亡能力。方法:以野生型和EB-8m变异型EBER2基因稳定转染的EB病毒阴性NPC细胞系HONE1和CNE1为研究对象,以未转染EBER2基因细胞为对照,分别用10 000 IU/mLα-干扰素(IFN-α)和2μg/mL顺铂诱导凋亡后以流式细胞术检测细胞凋亡;采用Western blot检测IFN-α诱导凋亡细胞中PKR及下游eIF2α和c-Jun的磷酸化蛋白及Bcl-2蛋白表达水平。对EBER2基因转染细胞进行RNA和PKR蛋白免疫共沉淀,检测共沉淀产物中EBER2富集倍数。结果:EBER2基因转染细胞的凋亡率低于未转染EBER2基因细胞(P<0.05或P<0.01),且变异型的细胞凋亡率低于野生型(P<0.05)。与未转染EBER2基因细胞比较,EBER2转染细胞中磷酸化PKR、eIF2α和c-Jun减少,Bcl-2表达升高,且磷酸化PKR在变异型转染HONE1和CNE1细胞中的水平低于野生型转染细胞,磷酸化eIF2α在变异型转染HONE1细胞中的水平亦低于野生型转染细胞,差异均有统计学意义(P均<0.05)。EBER2基因转染细胞RNA和PKR免疫共沉淀产物中可检测到EBER2,且变异型的富集倍数高于野生型(P<0.05)。结论:EB-8m变异型EBER2可能增强EBER2对PKR的结合作用,同时抑制eIF2α和c-Jun磷酸化并上调Bcl-2表达,进而增强NPC细胞抗凋亡能力。