双链RNA特异性腺苷脱氨酶——DSRAD/ADAR1的研究进展

DSRAD/ADAR1是一种双链RNA特异性腺苷脱氨酶,主要生物学功能包括RNA编辑和诱导蛋白质在核内的翻译。它参与胚胎发育、中枢神经系统的神经递质传递、造血系统的发育、机体的免疫等生理学过程。由于它功能的复杂性和重要性,近年来倍受关注。新近研究表明,DSRAD/ADAR1基因突变可致遗传性对称性色素异常症(DSH)。本文就其结构和功能等方面的研究进展进行综述。

RNA特异性腺苷脱氨酶的生物学作用及其与人类疾病的关系

RNA编辑(尤其是A-to-I RNA编辑)是哺乳动物常见的转录后修饰方式。RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR)是A-to-I编辑的关键蛋白,它通过脱氨基作用使双链RNA中的腺苷基团转化为肌酐基团,从而导致核苷酸序列改变。目前已发现的ADARs共有3类(ADAR1,ADAR2,ADAR3),它们的异常与众多人类疾病密切相关,如病毒感染、代谢性疾病、神经系统疾病、肿瘤等。

腺苷脱氨酶1在肺腺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨RNA特异性腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA-1,ADAR1)在肺腺癌组织中的表达及其与患者临床病理特征和预后的相关性。方法通过免疫组织化学染色法检测2015年12月至2017年9月本院收治的131例肺腺癌患者术后组织标本以及相应癌旁组织中ADAR1的表达,分析ADAR1蛋白的表达与患者临床病理参数的关系,并利用Kaplan-Meier法分析ADAR1表达水平和患者总生存期(overall survival,OS)的关系,拟合Cox模型评价不同指标的预后价值。结果肺腺癌组织中ADAR1蛋白表达量为77.9%,显著高于相应配对的癌旁组织(12.5%,P<0.01),且ADAR1表达与患者临床分期和淋巴结转移有关(P<0.05),Kaplan-Meier分析表明ADAR1高表达与较短的OS显著相关(HR=2.671,95%CI:1.282~5.563,P<0.01);多因素Cox回归分析显示,临床分期和淋巴结转移(P<0.01)可作为肺腺癌患者预后评估的独立危险因素。结论 ADAR1在肺腺癌组织中高表达,且肺腺癌患者中ADAR1高表达提示预后不良。

lncRNA LINC00460和ADAR1表达与乳腺癌预后的关系及其诊断价值

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC00460和RNA特异性腺苷脱氨酶1(ADAR1)表达水平与乳腺癌预后的关系及其诊断价值。方法回顾性收集2019年5月至2020年5月同济大学附属第一妇婴保健院收治的86例乳腺癌患者的乳腺组织和癌旁组织。采用qRT-PCR法测定乳腺癌组织和癌旁组织中LINC00460和ADAR1的表达,同时分析LINC00460和ADAR1表达与乳腺癌患者临床病理的关系。Pearson相关性分析法分析LINC00460和ADAR1的相关性;Kaplan-Meier生存分析法分析LINC00460和ADAR1与乳腺癌患者预后的关系;Cox多因素回归法分析乳腺癌预后的影响因素。结果乳腺癌组织中LINC00460和ADAR1的相对表达量为4.13±1.24和5.07±1.62,均明显高于癌旁组织(0.91±0.27和1.03±0.39),差异均有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌组织中LINC00460和ADAR1的表达与TNM分期、淋巴结转移、病理类型有关(P<0.05)。乳腺癌组织中LINC00460与ADAR1的表达呈正相关(r=0.63,P<0.001)。LINC00460低表达患者的生存率为91.30%,显著高于LINC00460高表达者(77.50%),ADAR1低表达患者的生存率为91.83%,显著高于ADAR1高表达者(74.29%),差异均有统计学意义(P<0.05)。LINC00460、ADAR1、TNM分期、病理类型、淋巴结转移是影响乳腺癌预后独立的危险因素。结论LncRNALINC00460和ADAR1在乳腺癌组织中高表达,与TNM分期、淋巴结转移、病理类型有相关性,是影响乳腺癌预后的独立危险因素。

ADAR1通过RNA编辑上调ZNF655表达并促进人肝癌细胞系HepG2中HBV复制

目的探讨细胞中ADAR1对锌指蛋白ZNF655的作用及其对乙肝病毒(HBV)复制的影响。方法在人肝癌细胞系HepG2细胞中,利用桑格测序验证ZNF655 3'UTR存在ADAR1 RNA编辑位点;RT-qPCR检测ADAR1和ZNF655 mRNA的表达及HBV total RNA和HBV 3.5 kb RNA的表达;双荧光素酶报告基因检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR1和ZNF655蛋白的表达;ELISA检测ZNF655对HBV标志物HBs Ag和HBe Ag的影响。结果 ZNF655基因3'UTR上chr7:99575277位点在DNA水平为纯合型,在RNA水平为杂合型;ZNF655基因3'UTR上chr7:99575277位点的编辑型G比正常型A的荧光素酶活性显著升高(P<0.001);在转录和翻译水平,ADAR1都显著增加了ZNF655的表达(P<0.001);ZNF655对HBV的表达起到促进的作用。结论 ADAR1通过编辑ZNF655的3'UTR上的chr7:99575277位点,使编辑位点A转换成G,上调了基因的表达,进而起到对HBV复制的促进作用。

RNA编辑酶ADAR1在Huh7.5.1细胞中抑制HCV复制的研究

目的:探究干扰素在Huh7.5.1细胞中对RNA编辑酶(adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1)表达的影响,以及ADAR1对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)复制的调控作用。方法:干扰素(IFN-α,30 IU/m L)刺激Huh7.5.1细胞后,利用real-time PCR和Western blot检测ADAR1表达水平的变化,同时HCV以一定滴度(0.2 MOI)感染Huh7.5.1细胞,观察IFN-α对HCV复制的影响;利用si RNA降低ADAR1表达,过表达质粒(ADAR1 p110和p150)增加ADAR1表达,并进一步利用基因编辑技术建立ADAR1稳定敲除细胞株,明确ADAR1与HCV的复制关系。结果:IFN-α诱导Huh7.5.1细胞ADAR1 p150表达(48 h:t=10.400,P=0.007;72 h:t=19.390,P=0.002),而不影响ADAR1 p110表达(48 h:t=0.806,P=0.472;72 h:t=1.929,P=0.133),同时IFN-α可显著抑制HCV复制(48 h:t=10.170,P=0.001;72 h:t=35.810,P=0.000)。ADAR1 p110和p150过表达48 h后,HCV病毒核酸和蛋白水平均明显低于空白对照(P=0.004,P=0.015);ADAR1 si RNA干扰后,HCV复制增加了2倍以上,差异显著(t=13.530,P=0.000);利用Crispr-cas9技术敲除掉Huh7.5.1中的ADAR1后,HCV复制也明显增加(t=5.259,P=0.023);ADAR1干扰后IFN-α仍然存在对HCV明显的抑制作用(t=9.146,P=0.001)。结论:IFN诱导蛋白ADAR1可以抑制HCV复制,且ADAR1部分介导了IFN-α对HCV复制的抑制。

泛素连接酶SMURF1催化ADAR1的多聚泛素化修饰

既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕获并鉴定THP-1细胞中SMURF1的相互作用蛋白质集合物,发现在THP-1细胞中SMURF1可与222种蛋白质物理性结合,RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)具有较高的肽段结合分数。构建SMURF1过表达载体并转染到HEK-293T细胞中,Co-IP和Western印迹检测验证外源性SMURF1与内源性ADAR1存在相互作用。qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,在HEK-293T细胞中过表达SMURF1后ADAR 1 mRNA水平差异无统计学意义、蛋白质水平明显降低(P<0.05)。用放线菌酮(CHX)分别处理正常和过表达SMURF1的HEK-293T细胞,Western印迹检测显示,过表达SMURF1后ADAR1的半衰期缩短(P<0.05)。进一步在HEK-293T细胞中共转染泛素(Ub)过表达载体和SMURF1过表达载体,通过Co-IP和Western印迹检测结果证实,过表达SMURF1后ADAR1的多聚泛素化水平显著增加(P<0.05)。在蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,Western印迹检测结果表明,蛋白酶体降解途径受抑制后SMURF1对ADAR1的负调控作用减弱(P<0.05)。本研究表明,SMURF1可以与ADAR1相互作用,催化ADAR1的多聚泛素化修饰并介导其蛋白酶体途径降解,为探索SMURF1通过影响ADAR1蛋白质稳定性而具备的多种生物学功能提供理论基础。

腺苷脱氨酶1在肺腺癌组织的表达及其与预后的关系

目的探讨腺苷脱氨酶l（ADAR1）在肺腺癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学染色检测48例肺腺癌患者肿瘤组织与癌旁正常组织中ADAR1蛋白表达水平。应用实时定量反转录聚合酶链反应（RT—qPCR）检测肺腺癌患者肿瘤组织与癌旁正常组织中ADAR1基因表达水平。结果肺腺癌组织中ADAR1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织（60．4％比20．8％，P〈0．05）。肺腺癌组织中ADAR1基因表达水平显著高于癌旁正常组织（1．58比1．19，P〈0．05）。肺腺癌组织中ADAR1蛋白阳性表达率与肿瘤TNM分期（X2=7．779，P〈0．05）和淋巴结转移（X2=4．516，P〈0．05）密切相关。Kaplan—Meier生存分析显示，ADAR1高表达组患者的总生存期（OS）较低表达组明显缩短，其中ADAR1高表达组（29例）中位生存时间为27个月；低表达组（19例）中位生存时间为56个月，差异有统计学意义（X2=8．916，P〈0．01）。Cox比例风险回归模型分析结果显示，ADAR1蛋白表达水平、TNM分期是影响预后的独立因素（P〈0．05）。结论ADAR1在肺腺癌中高表达与患者预后差密切相关。

RNA腺苷脱氨酶对社会隔离小鼠攻击行为的缓解作用及5-羟色胺-2C受体机制

目的探讨RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)作用于5-羟色胺-2C受体对社会隔离小鼠攻击行为的缓解作用。方法60只21日龄的健康雄性BALB/c小鼠按照随机数字表法分为6组:社会隔离组、群居对照组、ADAR1诱导剂隔离组、ADAR1抑制剂隔离组、ADAR1诱导剂群居组和ADAR1抑制剂群居组,采用单笼饲养4周方法建立社会隔离模型,采用群居饲养方法作为对照组。ADAR1诱导剂隔离组和ADAR1抑制剂隔离组分别给予ADAR1诱导剂(5.0×10^4U/kg)和抑制剂(10 mg/kg)进行腹腔注射。采用入侵者实验评价小鼠的攻击性行为,免疫组化和蛋白免疫印迹实验检测小鼠脑内ADAR1和5-羟色胺-2C受体的表达变化。结果社会隔离组小鼠的攻击潜伏期明显低于群居对照组[(43.15±6.99)s,(542.40±30.50)s;t=15.906,P<0.01],ADAR1诱导剂隔离组小鼠的攻击潜伏期[(256.70±29.49)s]明显高于社会隔离组(t=7.046,P<0.01),ADAR1抑制剂隔离组小鼠的攻击潜伏期[(15.25±2.18)s]明显低于社会隔离组(t=3.809,P<0.01)。社会隔离组小鼠杏仁核各区ADAR1免疫反应阳性表达细胞的光密度值显著低于群居对照组相应脑区[BLA区:(0.038±0.002),(0.074±0.004);LaDL区:(0.033±0.002),(0.060±0.002);LaVM区:(0.045±0.003),(0.073±0.004);LaVL区:(0.044±0.003),(0.070±0.003);t=8.428,9.037,6.462,5.698,均P<0.01];ADAR1诱导剂隔离组小鼠的杏仁核区ADAR1免疫反应阳性表达细胞的光密度值[BLA区:(0.060±0.003),LaDL区:(0.042±0.002),LaVM区:(0.056±0.004),LaVL区:(0.054±0.003)]明显高于社会隔离小鼠对应脑区,分别为(t=6.055,2.876,2.312,2.492;均P<0.05]。社会隔离组小鼠杏仁核区ADAR1蛋白和5-羟色胺-2C受体蛋白的表达均明显低于群居对照组(t=11.37,12.65;均P<0.01)。ADAR1诱导剂隔离小鼠杏仁核区ADAR1蛋白和5-羟色胺-2C受体蛋白表达均明显高于社会隔离组(t=3.02,4.401;均P<0.05)。结论ADAR1诱导剂可通过增强社会隔离BALB/c小鼠杏仁核5-羟色胺-2C受体的蛋白表达缓解社会隔离BALB/c小鼠的攻击性行为。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ADAR1与IFN-α的相关性及临床意义

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中RNA腺苷脱氨酶1(ADAR1)与血清IFN-α的表达量,并分析二者的相关性及临床意义。方法选取2019年1-8月于郑州大学第一附属医院风湿免疫科住院治疗的30例SLE女性患者作为SLE组,选取同时期30名健康女性作为对照组,使用定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SLE患者PBMCs中ADAR1 mRNA的相对表达水平。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中IFN-α表达水平。收集临床资料,评估患者的临床症状并计算SLE活动指数(SLEDAI),用SPSS 21.0软件分析ADAR1与IFN-α表达水平、SLEDAI、补体3(C3)、补体4(C4)和24 h尿总蛋白(24 h UTP)的相关性。结果 SLE组血清IFN-α[82.06(46.44,177.63)pg·mL-1](P<0.01)和PBMCs中ADAR1[0.73(0.27,1.54)](P<0.05)表达水平均高于对照组。当血清IFN-α水平<260.0 pg·mL-1时,SLE组PBMCs中ADAR1表达水平与IFN-α水平呈正相关(P<0.05),ADAR1表达水平与SLEDAI (P<0.01)及24 h UTP水平呈正相关(P<0.01),血清IFN-α表达水平与SLEDAI呈正相关(P<0.01),与C3呈负相关(P<0.05)。结论 SLE患者中异常表达的IFN-α可能参与调节ADAR1的表达,PBMCs中的ADAR1或可成为一个评估SLE疾病活动度的潜在生物标志物,为靶向治疗提供了理论基础。

ADARs在肿瘤中的研究进展

RNA特异性腺苷脱氨酶(ADARs)在RNA转录后的修饰过程中发挥重要作用,是导致生物多样性的原因之一,通过对RNA编码区或非编码区相关位点的编辑,影响人类疾病的发生、发展。尽管它已成为多种疾病研究中的热点,但其完整的生物学意义尚未完全阐明。ADARs的表达失衡与人类肿瘤的进展及肿瘤患者的预后密切相关,但是,到目前为止,其确切的作用机制尚未完全阐明。因此,通过对ADARs及其编辑位点的进一步研究,在转录后水平阐明肿瘤发生的潜在机制,可以为肿瘤的诊断、治疗新方法的探索提供理论基础。

鸡源ADAR2基因克隆及其抗新城疫病毒作用研究

目前对家禽中双链RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on double-stranded RNA,ADAR)的种类、组织分布及其功能尚不明了。本研究中以刀豆素、poly I:C以及新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为刺激物诱导鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)中ADARs基因上调,扩增获得鸡ADAR2基因的mRNA。为了鉴定ADAR2的抗病毒作用,本研究构建了能够偶联有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的ADAR2重组真核表达质粒,转染DF1细胞,结果显示在过量表达ADAR2的细胞中,NDV的增殖受到了显著抑制,表明ADAR2在NDV感染过程中发挥重要的抗病毒作用,这为进一步研究鸡RNA编辑酶对NDV RNA编辑奠定了基础。

Z-DNA结合蛋白与Zα结构域

Z-DNA结合蛋白包括人、哺乳类和病毒中的ADAR1、DLM-1、E3L蛋白以及在鱼类中最新报道的PKR-like(PKZ),其共同点是都含有Zα结构域。本文简述了这几种蛋白质的结构与功能,并着重分析Zα结构域与Z-DNA、Z-RNA、B-DNA等核酸分子的识别机制和亲和性。

社会隔离对BALB／c小鼠认知功能和海马5-HT2CR、ADAR1表达的影响

目的探讨社会隔离对BALB／c小鼠认知功能及5羟色胺2c受体（5-HT2Creceptor，5-HT2CR）和RNA腺苷脱氨酶1（adenosinedeaminasethatactOnRNA1，ADARl）表达的影响。方法选取健康BALB／c小鼠，按照随机原则（随机数字表法）分组，分别自生后21d起单笼饲养2周、4周和8周，建立社会隔离模型。对应的相同年龄正常群居饲养BALB／c小鼠作为相应对照组。采用新物体定位和新物体识别实验评估小鼠空间和非空间认知功能的改变，采用免疫蛋白印迹实验检测小鼠脑海马区5-HT2CR和ADARl表达的改变。结果新物体定位和新物体识别实验结果显示，与相应对照组相比，隔离2周组BALB／c小鼠的空间辨别指数明显降低[对照组为（0．075＋0．340），隔离组为（一0．653＋0．308），P〈O．05]，隔离2周和4周组BALB／c小鼠空间辨别指数无明显差异；隔离2周和4周组BALB／c小鼠非空间辨别指数明显降低[对照2周组为（0．088＋-0．210），隔离2周组为（-0．945＋-0．194），P〈0．05；对照4周组为（0．105＋0．267），隔离4周组为（-0．506＋-0．215），P〈0．05]，隔离8周组没有明显的改变；Westernblot结果显示，在海马区，与相应对照组相比，隔离2周BALB／c小鼠的5-HT2CR和ADARl蛋白表达明显减少[5-HT2CR：对照组为（1．025＋-0．144），隔离组为（0．891＋-0．026），P〈0．05][ADARl：对照组为（0．839--0．120），隔离组为（O．629＋-0．094），P〈0．05]。结论2周社会隔离可导致BALB／c小鼠的空间和非空间认知功能降低，同时引起BALB／c小鼠海马区5-HT2CR和ADARl蛋白表达的降低。

ADAR1诱导剂和抑制剂对社会隔离小鼠认知功能及ADAR1蛋白表达的影响

目的 探讨ADAR1诱导剂和抑制剂对社会隔离BALB/c小鼠认知功能和ADAR1表达的影响.方法 选取60只健康BALB/c小鼠按照区组随机化分为6组：群居对照组（GH）、社会隔离模型组（SI）、ADAR1诱导剂干预群居组（GH＋ IFN-γ）、ADAR1抑制剂干预群居组（GH＋EHNA）、ADAR1诱导剂干预隔离组（SI＋IFN-γ）和ADAR1抑制剂干预隔离组（SI＋EHNA）,每组10只小鼠.干预方式为腹腔注射,ADAR1诱导剂或抑制剂的给药剂量分别为5.0× 104 U/kg或10 mg/kg.采用物体识别实验检测小鼠认知功能改变.免疫组化和Western blot检测小鼠脑内ADARI的免疫反应活性和蛋白表达的改变.结果 在物体识别实验中,与GH组（0.41±0.17）相比,SI组（-0.16 ±0.09）小鼠的非空间辨别指数明显降低（P＜0.01）;SI＋IFN-y组（0.20±0.09）和SI＋EHNA组（-0.29 ±0.12）小鼠的非空间辨别指数分别高于（P＜0.01）和低于SI组（P＜0.05）.免疫组化实验结果显示,与GH组相比,SI组小鼠海马Hilus区[（0.021±0.002）,（0.013 ±0.003）,P＜0.01]和CA1区[（0.047 ±0.004）,（0.021±0.005）,P＜0.01]的ADARI免疫反应活性明显减弱;与SI组相比,SI＋ IFN-γ组小鼠海马Hilus区[（0.013 ±0.003）,（0.023±0.004）,P＜0.01]和CA1区[（0.021±0.005）,（0.040 ±0.005）,P＜0.01]的ADAR1免疫反应活性明显升高,ADAR1诱导剂干预隔离组逆转社会隔离引起的降低的ADAR1免疫反应活性.Western blot结果显示与GH组（1.00±0.00）相比,SI组小鼠海马区ADAR1的蛋白表达（0.48±0.07）明显降低（P＜0.01）;SI＋IFN-γ组小鼠海马区ADAR1的蛋白表达（0.82±0.04）与SI组相比,明显增加（P＜0.01）.结论 4周社会隔离应激刺激可导致BALB/c小鼠的非空间认知能力降低,海马区ADARI表达降低,ADARI诱导剂和抑制剂可分别逆转和加重社会隔离引起的认知功能障碍,相关机制与ADAR1表达有关.

三例遗传性对称性色素异常症的基因突变研究

遗传性对称性色素异常症(dyschromatosis symmetrica hereditaria,DSH)是一种常染色体显性遗传性皮肤趑病.2003年,中国[1]和日本[2]的两个研究组各自完成了DSH致病基因的定位工作,家系全基因组扫描连锁定位于1号染色体上.日本的研究组首先发现了该病的致病基因为双链RNA特异性腺苷脱氨酶(double-strand RNA-specific adenosine deaminase,DSRAD)基因,该基因突变导致DSH的发生[2].目前国际上已报道突变位点10余个[2-6],本研究在此基础上,对3例DSH患者进行基因组DNA检测,以期发现新的基因突变位点.

ADAR基因新发突变致遗传性对称性色素异常症一家系研究

目的探讨一家系2例遗传性对称性色素异常症患者基因突变情况。方法收集一家系2例遗传性对称性色素异常症患者的临床资料。采集该家系先证者及其父母、100例健康对照者外周血,提取基因组DNA,采用高通量测序法检测皮肤病相关基因各外显子编码区域序列,应用PCR-Sanger测序验证突变基因,应用GERP++、PyMOL、SPIDEX、SIFT和Polyphen等生物信息软件预测突变基因编码的蛋白结构及致病性。结果先证者临床表现为双手背及足背对称性褐色色素沉着斑和色素减退斑,先证者父亲临床表现为面部、双侧锁骨、双手背及腕部、双足背及踝部对称性褐色色素沉着斑和色素减退斑,该家系3代以内其他成员均无类似皮损表现。基因测序结果显示,先证者及其父亲RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR)基因第2外显子发生c.716G>A(p.Arg239Gln)杂合错义突变,导致其编码蛋白的第239位氨基酸由Arg突变为Gln;先证者母亲及100例健康对照者均未发现该突变。生物信息软件预测结果显示,ADAR基因突变后对应蛋白结构发生变化,该位点突变为疑似致病性突变。结合患者临床表现、基因测序及软件分析结果,诊断为遗传性对称性色素异常症。结论ADAR基因c.716G>A(p.Arg239Gln)杂合错义突变可能是该家系2例遗传性对称性色素异常症患者的致病原因。