PSMA增强子/启动子特异性驱动shRNA靶向干扰EGFP的研究

目的:探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA转录效果,比较何种终止序列最有效。方法:分别以poly(A),minipoly(A),poly(U)为终止序列设计针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的干扰序列,克隆入经SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pPSMAe/p载体上。然后通过脂质体介导,将各重组干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染PC-3和LNCaP细胞,采用荧光显微镜,流式细胞仪,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测EGFP在各组细胞中的干扰效果。结果:重组质粒中成功插入了目的基因片段;荧光显微镜和流式测定结果显示各干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染LNCaP后,各干扰组荧光表达均有不同程度减少,与空载体组相比均有统计学差异(P<0.01),pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)组减少与pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)组相比有统计学差异(P<0.05),与pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)组相比有显著统计学差异(P<0.01)。各干扰载体与pEGFP-C1质粒共转染PC-3后各组荧光表达无统计学差异(P>0.05),EGFP mRNA和蛋白表达水平无明显差异;LNCaP细胞各干扰组中EGFP mRNA和蛋白表达与空载体对照组相比均有不同程度下降,以pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)组最为明显。结论:成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)、pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)和pPSMAe/p-shEGFP-poly(U);PSMAe/p可特异性驱动shRNA转录;poly(A)终止信号终止转录最有效。

口蹄疫病毒链特异性荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了定量检测口蹄疫病毒(FMDV)的正链和负链RNA,揭示FMDV复制的分子机制,试验采用链特异性荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)方法提取了FMDV的RNA,在FMDV链特异性反转录引物的5'端引入非病毒基因序列标签进行反转录,再经链特异性ssqRT-PCR扩增进行灵敏性、特异性、重复性检测。结果表明:FMDV基因组正链、负链RNA的链特异性ssqRT-PCR方法构建成功,该方法对FMDV正链和负链RNA检测的灵敏度达到1×101拷贝,具有较好的重复性和特异性。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子 1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体 ,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白 (GFP) EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP N2 /EOLA1,并转染人ECV30 4细胞株 ,G4 18压力筛选获得稳定表达株 ;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸 ,插入pSlincer3.1/H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP EOLA1融合蛋白的ECV30 4细胞 ,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westernblot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP EO LA1融合蛋白的细胞株 ,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siR NA质粒 ,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

miR-155靶向调控SP1、E2F2mRNA转录水平的功能验证

目的观察微小RNA155(miR-155)对端粒酶逆转录酶(h TERT)调控相关蛋白特异性蛋白1(SP1)及转录因子E2F2重组质粒表达的影响,为进一步研究miR-155调控肿瘤细胞h TERT表达的机制提供实验基础。方法采用生物信息学预测软件Target Scan和Miranda预测SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR是否是人miR-155的作用靶点。针对SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR设计互补的两条寡核苷酸,包括目标序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突变序列(SP1-mu、E2F2-mu),构建SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR报告基因载体p MIR-SP1、p MIR-E2F2、p MIR-SP1-mu和p MIRE2F2-mu。培养HEK-293细胞,采用脂质体法将SP1和E2F2的野生型和突变型p MIR-Luc质粒共转染HEK-293细胞24 h。将细胞分为SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组、E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组,均加入0.2μg重组质粒、0.01μg对照质粒和0.375μL寡核苷酸,培养24 h。采用双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性,以萤火虫荧光素酶活性值(F)/海肾荧光素酶活性值(R)比值评价miR-155与SP1及E2F2 mRNA 3'-UTR结合效果。结果在线预测结果示,SP1 mRNA 3'-UTR和E2F2 mRNA 3'-UTR均有与miR-155完全互补配对的序列,确定二者均为miR-155的靶基因。经鉴定,SP1和E2F2报告基因重组质粒构建成功。SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组(P均<0.05),E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组(P均<0.05)。结论成功构建了SP1和E2F2报告基因重组质粒,证实miR-155能够靶向结合SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR,在转录后水平抑制SP1和E2F2的表达。

血清中不同基因型丙型肝炎病毒RNA含量的测定

目的了解血清中不同基因型丙型肝炎病毒HCVRNA的含量。方法用实时荧光定量RTPCR和逆转录型特异性引物PCR同时检测21例费城酒精依赖丙肝患者的血清HCVRNA拷贝数并分析HCV基因型。结果21份血清标本中,有17份为HCVRNA阳性。这些阳性血清的HCVRNA含量波动范围在104.60～106.20拷贝/ml。检测到1a和1b两种HCV基因型,其中1a型7例,RNA平均滴度为105.28±0.75拷贝/ml,1b型(9例)RNA平均滴度为105.28±0.28拷贝/ml。结论定性和定量检测结果有极佳的一致性,酒精依赖丙肝基因型1a和1b血清中HCV含量无显著性差异。

中国鲤科鱼类染色体核仁组织区进化的异质性及特殊性

核仁组织区（NORs）是具有重要功能的染色体区域.NORs的经典显示方法是硝酸银染色。但是硝酸银染色的一个缺陷是不能显示失活的NORs。最近国外许多学者的研究表明,GC碱基特异性DNA结合荧光染料色霉素A?

特异性双链RNA对小鼠干细胞和转基因荧光蛋白的抑制作用

目的研究特异性dsRNA对小鼠ES细胞中对核外基因和核内染色体基因的干扰作用,并对RNA干扰(RNAi)技术在皮肤病基因治疗领域中应用的可能性进行初步探讨。方法选择荧光蛋白基因为靶基因,通过质粒或RNA直接转染技术,将荧光蛋白双链RNA(dsRNA-EGFP)转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞),从而观察该细胞中特异性RNAi作用。并通过皮肤局部注射dsRNA-EGFP和局部外用脂质体包裹的dsRNA-EGFP,观察EGFP转基因鼠皮肤EGFP的表达。结果无论是转染质粒产生的dsRNA-EGFP或是直接转染的dsRNA-EGFP,均明显抑制ES细胞核外或染色体中EGFP基因的特异性表达。局部皮肤注射或皮肤外用脂质体-dsRNA-EGFP均特异性抑制EGFP转基因鼠皮肤EGFP的表达。结论本研究证实了小鼠ES细胞中特异性RNAi的作用。

RNA恒温扩增检测技术用于诊断儿童肺炎支原体肺炎

目的探讨儿童肺炎支原体肺炎(MPP)采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术(SAT)诊断的临床价值。方法将我院儿科收治的102例肺炎患儿分别进行SAT和MP血清学抗体(MP-Ab)检测,其中MPP患儿40例,非MPP患儿62例。对比RNA-SAT与MP-Ab检测MPP的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。进行RNA-SAT检出MPP影响因素的单因素、logistic多因素回归分析。结果 RNA-SAT检测MPP敏感性、阳性预测值和MP-Ab比较明显较高(P<0.05)。logistic多因素回归分析显示,病程≥7 d、应用大环内酯类药物治疗是影响MP-SAT诊断的主要因素(P<0.05)。结论 MP-SAT可弥补MP-Ab检测MPP的周期,具有较高的特异性和阳性预测值,在MPP早期诊断中具有重要应用价值,病程≥7 d和院外应用大环内酯类药物是影响其检测结果的主要因素。

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)中,重组质粒pcDNA3.1(+)-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12

miR-30b的组织特异性研究

目的:研究miR-30b的组织特异性,检测其在心,肝,脑,肾,脾和骨骼肌中的表达情况。方法:选取C57BL/6J雄性小鼠6只,用real-time PCR方法检测小鼠心,肝,脑,肾,脾和骨骼肌中miR-30b的表达量。结果:miR-30b在小鼠肝脏中表达量最低,与肝相比,在心,脑,肾,脾和骨骼肌中的相对表达量分别为13.13±0.899,9.497±0.717,4.478±1.031,6.751±0.596,2.538±0.79。且与肝相比均具有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-30b在各组织中的表达存在差异,在心脏中的表达量最高,提示miR-30b可能与心脏的发生发展密切相关,为深入探索miR-30b的功能奠定了基础。

实时荧光定量PCR检测细菌方法的建立及其临床应用

目的探索快速可靠的新生儿败血症和化脓性脑膜炎诊断的新方法及其临床运用.方法用自行设计的细菌16S rRNA基因高度保守区的引物和探针,对19种标准菌株、3种病毒株、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA,以及疑似败血症的临床血标本、脑脊液共195份进行荧光定量检测,并同时进行血或脑脊液培养的对照.结果细菌荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于1～2个细菌,与人基因组DNA、真菌及病毒等无交叉阳性反应;荧光定量PCR的细菌DNA检出率为12.8%(25/195),明显高于血培养的阳性率7.1%(15/195,P＜0.01).结论应用通用引物和探针的荧光定量PCR扩增诊断败血症的方法检测快速、敏感性和特异性高,具有较大的推广及应用价值.

不同强度冷刺激对大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中CIRP表达的影响

采用Western blot和实时荧光定量RT-PCR方法,研究不同强度不同时间冷刺激后大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达情况.结果表明:常温(20℃±1℃)下大鼠4种组织中均存在一定的CIRP的表达;急性冷刺激组(-10℃±1℃、-4℃±1℃、0℃±1℃、4℃±1℃)心脏、大脑和睾丸中CIRP mRNA表达在冷刺激0～6 h呈上升趋势,6 h时达到最高值,随后呈下降趋势,肺脏中CIRP mRNA表达在0～6 h呈下降趋势,在6 h时达到最低值,随后呈上升趋势;慢性冷应激组(10℃±1℃)大鼠心脏、大脑和睾丸3种组织中CIRP mRNA在不同时间点(1周、2周、3 W周)的表达均高于正常对照组(P>0.05),肺脏CIRP mRNA表达均低于对照组(P>0.05),并且同一组织不同时间点之间差异不显著(P>0.05).可见冷刺激后CIRP的表达存在一定规律并且表现出组织特异性,可能与组织保护特异性有关.