基于mRNA稳定性推断死亡时间的研究

目的探讨大鼠死后不同时间肾、脾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA的表达对死亡时间(PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,分别于死后0,8,16,24,32,40,48h共7个时相点(n=4)解剖,利用荧光RT-PCR技术检测大鼠肾、脾GAPDHmRNA相对表达量的变化。结果在大鼠死后40h肾、32h脾内可检测出GAPDHmRNA,且其表达产物均呈规律性下降趋势(荧光强度逐渐变暗并最终消失)。结论检测大鼠死后不同时间肾、脾GAPDHmRNA的表达对PMI推断具有一定的应用价值。

细菌RNA稳定性调控相关元件的研究进展

RNA降解体(细菌RNA降解的主要执行者)是一种多亚基的蛋白质复合物,主要由RNA解螺旋酶、聚核苷酸磷酸化酶(polynucleotide phosphorylase,PNPase)、内切核酸酶(ribonuclease E,RNase E)以及糖酵解途径中的烯醇化酶、磷酸果糖激酶等组成,参与核糖体RNA(ribosome RNA,rRNA)的加工以及信使RNA(messenger RNA,mRNA)的降解。此外,RNA分子伴侣Hfq和调控小RNA(small RNA,sRNA)在RNA稳定性调控中也发挥着重要作用。综述了细菌RNA稳定性调控相关功能元件,特别是降解体蛋白及RNA分子伴侣Hfq的最新进展,以期为研究细菌RNA稳定性及其参与的代谢调控提供理论参考。

N^6-甲基腺苷依赖的信使RNA稳定性调节

N^6-甲基腺苷（N^6-methyladenosine，m^6 A）修饰是现今最常见的高等真核生物信使RNA（mRNA）内部（非帽子结构）修饰，是在转录后由m^6A甲基转移酶（如MT-A70）在序列的G（m^6A）C（70％）或A（m^6A）C（30％）部位上加工形成的。这种修饰对于细胞的存活和发育是必不可少的，但其确切作用仍有待进一步研究。

雌激素对SLE患者T细胞CD154 mRNA稳定性的影响

目的探讨SLE患者T细胞CD154表达的雌激素依赖性增加是否与其mRNA的稳定性变化相关。方法用不含或含有17-β雌二醇（10^-7mol／L）的无血清培养液培养SLE女性患者（10例）及正常人对照（7例）的T细胞共18h。取一部分T细胞放至用抗CD3包被的培养皿中进一步培养激活，并在平行培养中加入放线菌D以阻止新的mRNA合成。CD154 mRNA的稳定性用RT—PCR测定，并与不经刺激的T细胞（静止细胞）作对照。结果静止的SLET细胞在含雌二醇的培养液中CD154／G3PDH为36．9～100，x^-=75．5；不含雌二醇的CD154／G3PDH为14．5～100，x^-=73．6，两组比较，P=0．88；正常T细胞分别为34．2～100，x^-=76-3和47～100，x^-=74．3，两组比较，P=0．65。在对雌激素应答过程中，静止的SLET细胞和正常T细胞mRNA的稳定性差异均无统计学意义。同样，激活的SLET细胞在含雌二醇的培养液中CD154／G3PDH为34～100，x^-=86．8；不含雌二醇的CD154／G3PDH为28．5～100，x^-=54．5，两组比较，P=0．15；正常T细胞分别为73～100，x^-=87．7和40～98，x^-=68．1，两组比较，P=0．077。在雌激素的作用下，激活的SLET细胞和正常T细胞CD154 mRNA的稳定性差异也无统计学意义。结论SLET细胞中CD154的雌激素依赖性表达增加并不是由mRNA稳定性变化引起。

DNA和RNA双链稳定性差异的理论研究

利用适用于分子间弱相互作用,尤其是生物分子间的氢键相互作用的改进的半经验方法RM1BH和达到线性标度的新的半经验算法以及SimuCal_SE方法,与自主开发的量子化学程序包SimuPac1.0,对4组一系列DNA和RNA碱基的氢键结合能进行了计算.这些计算包括单一碱基类型和混合碱基类型两大类情形,最大的原子数达到1064个.计算结果表明,在碱基层数较少时,DNA和RNA氢键结合能差别不大;在碱基层数较多时,RNA的氢键结合能明显高于DNA的氢键结合能;嘌呤和嘧啶的排列方式对结合能略有影响,但不影响上述趋势.可见,氢键对于RNA的稳定性差异起到重要的作用,计算结果支持了实验的结论.

LncRNA-GAS5抑制miR-21介导的非完全匹配靶mRNA降解

LncRNA-GAS5作为miR-21的"分子海绵",通过"吸收"miR-21从而调控miR-21对靶基因的抑制.此外,miR-21直接调控非完全匹配靶基因PTEN和TPM1的表达.我们首先在HEK293T和HeLa细胞中确认,miR-21通过碱基互补配对调控非完全匹配靶基因PTEN和TPM1的蛋白表达,但不影响PTEN和TPM1mRNA的水平.此外,过表达miR-21后,qRT-PCR检测PTEN和TPM1mRNA的半衰期,发现它们的半衰期显著缩短,miR-21加速PTEN和TPM1mRNA的降解.通过转染lncRNA-GAS5的过表达质粒,发现lncRNA-GAS5竞争性地与miR-21结合能够延长PTEN和TPM1mRNA的半衰期,而miR-21与lncRNA-GAS5碱基互补配对结合后,又对lncRNA-GAS5存在调节作用,减弱lncRNA-GAS5的稳定性并加速lncRNA-GAS5的降解.LncRNA-GAS5作为miR-21的"分子海绵"能够抑制miR-21对非完全匹配靶mRNAPTEN和TPM1的降解,同时,miR-21与lncRNA-GAS5结合后又存在对lncRNA-GAS5的反馈调节,这些相互作用机制的发现有助于了解lncRNA、miRNA、mRNA之间这个复杂又精细的调控环路.

离心前保存和冷冻保存时间对HCVRNA含量的影响

目的:探讨标本离心前保存和冷冻保存时间对丙型肝炎病毒(HCV)核糖核酸(RNA)含量的影响。方法:筛选高、低载量的HCV RNA反应性标本各一个,接驳混匀其血浆和浓缩红细胞,从混匀好的2个血袋中各留取48支试管,每12管为一组,分为离心前保存0、4、8、24 h组,比较离心后各组间HCV RNA检测结果。挑选HCV RNA反应性标本一个,从其浆袋中留取32支试管冷冻保存,每8管为一组,分为冷冻保存1、7、30、40 d组,比较各组间HCV RNA检测结果。结果:4℃保存条件下,高、低载量组在离心24 h内各个时间段的HCV RNA含量差异无统计学意义(P>0.05),但各时间点高载量组HCV RNA含量明显高于低载量组(P<0.01);-20℃保存条件下,40 d内不同冷冻保存时间HCV RNA含量差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:血站核酸检测标本4℃保存可在24 h内离心,-20℃保存可在40 d内完成检测。

基于核酸DNA/RNA同位素示踪技术的水稻土甲烷氧化微生物研究

稳定性同位素示踪复杂土壤中微生物DNA/RNA的技术难点是13C-DNA/RNA的鉴定。本研究针对我国六种典型水稻土,利用稳定性同位素13CH4示踪活性的甲烷氧化菌,超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA/RNA后,以甲烷氧化菌独有的pmo A功能基因和16S r RNA特异基因作为分子标靶,通过半定量凝胶电泳技术评价了特异基因作为分子标靶判定13C-DNA/RNA的可行性,进一步利用克隆文库技术研究水稻土中的活性甲烷氧化菌群落结构。结果表明:甲烷氧化菌功能基因pmo A作为分子标靶,能够准确鉴别13C-DNA,而甲烷氧化菌特异的16S r RNA基因则能较好地区分12C和13C标记的RNA,但13C-RNA中的非目标微生物污染高于13C-DNA示踪技术。进一步以13C-DNA和13C-RNA为模板,分别构建了pmo A和16S r RNA基因的克隆文库,系统发育分析表明I型菌主导了土壤甲烷氧化过程,其中江西鹰潭和黑龙江五常土壤中活性甲烷氧化菌全部属于Ia型,而四川资阳、浙江嘉兴、江苏常熟和江都土壤中Ia型和Ib型甲烷氧化菌均有发现,并且后者比例较低。这些结果表明分子标靶基因能够有效判定复杂土壤中的甲烷氧化菌13C-DNA/RNA,在DNA和RNA水平的结果基本一致,我国典型水稻土中活性甲烷氧化菌可能存在一定的地理分异规律。

外显子拼接复合体塑造m^(6)A表观转录组的形成

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m^(6)A)是mRNA中含量最丰富的化学修饰之一,在各种生理病理过程中发挥关键性的作用。m^(6)A修饰主要位于mRNA终止密码子附近和长的内部外显子上,然而导致这一特异性分布的机制却一直不清楚。近期发表的3篇论文揭示了外显子拼接复合体(exon junction complexes,EJCs)作为m^(6)A修饰的抑制蛋白suppressors,塑造了m^(6)A表观转录组的形成,解决了这一重大问题。由此,本文简要介绍了m^(6)A修饰通路,并结合这些研究成果阐述了EJC对m^(6)A修饰形成的作用和机理,进而说明外显子-内含子结构通过m^(6)A修饰影响mRNA的稳定性,以期理解m^(6)A这一RNA表观修饰领域的最新进展。

血浆中丙型肝炎病毒核酸在不同保存条件下的稳定性研究

目的探讨不同的温度和时间条件对血浆中丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)稳定性的影响。方法选取在本院做HCV RNA定量检测的病人,采集患者外周血4 ml,并进行分装,将分装的血浆分别于室温保存7 d,4℃保存12 d,-20℃保存4周,反复冻融5次,利用实时荧光定量聚合酶链反应检测血浆HCV R N A在相应温度下不同时间点的水平,并分别与样本采集时的HCV RNA比较,比较不同保存条件下血浆HCV RNA的稳定性。结果血浆样本在室温保存7 d时,HCV RNA平均下降幅度≤2.51 U/m L;4℃保存12 d时,HCV RNA平均下降幅度≤1.95 U/m L;-20℃保存4周时,HCV RNA平均下降幅度≤1.41 U/m L;反复冻融5次时,HCV RNA平均下降幅度≤1.26 U/m L。结论血浆样本在-20℃保存4周、反复冻融5次时,HCV RNA水平下降的幅度并不明显;但室温保存7 d、4℃保存12 d时HCV RNA水平显著下降。因此,在日常的工作中应尽量避免在该温度和时间条件下保存及运输血浆,以保证HCV RNA。

胃癌中多基因甲基化状态及其表达的研究

目的了解胃癌中p16、E-cadherin、Runx3、DAPK和CHFR基因启动子CpG岛的甲基化状态,并探讨基因异常甲基化与mRNA表达的关系及其意义。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测12例胃癌患者癌组织及其相应的癌旁正常组织中5种基因的甲基化状态,以12例胃镜活检的正常胃组织作为对照,采用RT-PCR方法相应检测了5种基因的mRNA表达水平。并分析每种基因甲基化程度与表达水平之间的关系。结果胃癌组织中,p16、E-cadherin、Runx3、DAPK和CHFR基因的甲基化率分别为41.7%、8.3%、58.3%、33.3%和58.3%,相应的癌旁正常组织中,p16、E-cadherin、Runx3、DAPK和CHFR基因的甲基化率分别为8.3%、0.0%、8.3%、8.3%和16.7%,且75%的胃癌组织中至少有一种基因甲基化,显著高于癌旁正常组织25%(P<0.05),而健康对照组织中无基因甲基化,在甲基化的胃癌组织中均无p16、E-cadherin和DAPKmRNA表达,而癌旁正常组织、非甲基化的癌组织中均有其表达。结论胃癌中多基因启动子CpG岛高甲基化是一个频繁的事件,并且基因启动子高甲基化与其mRNA表达缺失有关,这可能参与了胃癌的发生发展。

SND1通过识别TINCR的甲基化位点促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长

目的探讨葡萄球菌核酸酶结构域蛋白1(SND1)与组织分化诱导非编码RNA(TINCR)的相互作用及其对TINCR表达水平和瘢痕疙瘩生长的影响。方法收集2016年6月-2018年5月在陕西省人民医院接受治疗的Ⅱ、Ⅲ度烧伤患者的瘢痕疙瘩组织样本(n=27)。运用生物信息学方法预测TINCR序列中的RNA甲基化位点;培养人原代正常皮肤成纤维细胞(HFs)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs),设置HFs组和KFs组。取对数生长期KFs,设置:(1)对照组、空载组及甲基转移酶样蛋白3(METTL3)过表达组;(2)对照组和3-脱氮基腺苷(DAA)组;(3)对照组、SND1重组蛋白组及SND1重组蛋白+DAA组。采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测HFs和KFs中TINCR的相对表达水平,甲基化RNA免疫沉淀技术(MeRIP)联合RT-qPCR检测TINCR的甲基化水平,Western blotting检测SND1和METTL3蛋白的相对表达水平,放线菌素D处理联合RT-qPCR检测TINCR残留水平,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力。取18只BALB/c裸鼠,构建瘢痕疙瘩异种移植模型,随机分为瘢痕疙瘩组、瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白组及瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白+DAA组,每组6只,采用HE染色观察瘢痕疙瘩组织生长情况,免疫组化染色和Western blotting检测SND1在瘢痕疙瘩组织中的表达水平。结果TINCR第三外显子含有7个潜在的RNA甲基化位点。与HFs相比,KFs中TINCR相对表达水平(5.43±0.35 vs.1.00±0.11,P<0.01)和甲基化水平(19.73%±1.56%vs.10.25%±1.13%,P<0.01)均明显升高,SND1和METTL3蛋白相对表达水平明显增高(P<0.01),甲基化的TINCR与SND1和METTL3均有结合。与空载组相比,METTL3过表达可促进METTL3 mRNA和蛋白的表达(mRNA:6.03±0.55 vs.1.09±0.09,P<0.01;蛋白:4.33±0.35 vs.0.96±0.08,P<0.01)、增高TINCR甲基化水平(32.89%±2.88%vs.19.04%±1.72%,P<0.01)和相对表达水平(4.65±0.32 vs.1.00±0.10,P<0.01)。与对照组相比,DAA处理可降低TINCR的稳定性[(8.50±1.13)h vs.(12.90±1.41)h,P<0.001]和甲基化水平(7.43%±0.55%vs.18.88%±1.76%,P<0.01),抑制KFs的活力和克隆形成能力(P<0.01)。与对照组相比,SND1重组蛋白处理可增加TINCR的稳定性[(23.95±1.25)h vs.(13.10±1.33)h,P<0.01]、细胞活力和克隆形成能力(P<0.01),但对TINCR甲基化水平(20.15%±1.74%vs.19.04%±1.77%,P>0.05)无明显影响;DAA处理可消除SND1重组蛋白对TINCR稳定性[(12.00±1.21)h vs.(23.95±1.44)h,P<0.01]、细胞活力和克隆形成能力的影响(P<0.01)。与瘢痕疙瘩组相比,瘢痕疙瘩+SND1重组蛋白组真皮层有大量成纤维细胞和胶原纤维,瘢痕疙瘩组织中SND1阳性细胞百分比(63.43%±3.32%vs.21.16%±4.67%,P<0.01)和蛋白相对表达水平(2.54±0.13 vs.1.00±0.10,P<0.01)明显增高;而经DAA处理后,瘢痕疙瘩组织中有大量疏松的胶原纤维,SND1阳性细胞百分比(38.52%±6.88%vs.63.43%±3.32%,P<0.01)和蛋白表达水平(1.07±0.09 vs.2.54±0.13,P<0.01)明显降低。结论KFs中TINCR呈高甲基化水平,SND1可识别并结合TINCR的甲基化位点,增强TINCR的稳定性,促进TINCR介导的瘢痕疙瘩生长。

骨桥蛋白在肝癌细胞中转录后调控的研究

目的分离鉴定在肝癌细胞HepG2和Hep3B中与骨桥蛋白(OPN)5′非翻译区(5′-UTR)结合后在转录后水平调节OPN mRNA的稳定性的mRNA结合蛋白。方法利用亲和纯化的方法分离和纯化OPN 5′UTR结合蛋白,质谱分析消化后的片段以鉴定蛋白;Hep3B细胞瞬时转染真核细胞翻译延长因子1A(EF1A)siRNA抑制EF1A,HepG2细胞瞬时转染(pcDNA3.1+EF1A)质粒过表达EF1A,Western blot检测OPN蛋白的表达,real-time PCR检测OPN mRNA半衰期的变化。结果质谱分析法确认此结合蛋白为EF1A。在HepG2细胞中过表达EF1A能通过加速OPN mRNA的降解而降低OPN表达;在Hep3B细胞中利用siRNA技术下调EF1A的表达能增强OPN mRNA的稳定性,进而增强OPN的表达。结论 EF1A作为一个去稳定因素作用于OPN 5′UTR,至少部分决定了Hep3B和HepG2细胞中OPN的表达。

KH型剪切调控蛋白:星形胶质细胞炎性细胞因子生成检测点

中枢神经系统(CNS)慢性炎性反应是许多神经退行性疾病和自身免疫性疾病的主要病理特点之一。作为免疫活性细胞,星形胶质细胞(Ast)在CNS炎性反应过程中发挥了重要作用。它可表达许多细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)等,这些细胞因子可直接或通过募集免疫细胞等途径间接促进炎性反应。检测点的存在可保证这些细胞因子的生成受到严密控制。细胞因子mRNA3’-非翻译区的腺苷酸/尿苷酸富含元件(ARE)由于可调节mRNA稳定性和翻译效率而扮演着主要检测点的角色。KH型剪切调控蛋白(KSRP)是一种RNA结合蛋白,可通过与ARE结合降低mRNA的稳定性。本研究检测了KSRP对Ast细胞因子表达和旁分泌表型的影响。笔者发现了一个包括TNF-α和L-1β在内的炎性介质网络。与同窝出生的对照小鼠相比,KSRP-/-小鼠Ast上述炎性介质的表达在RNA水平增高了2～4倍。而这种KSRP-/-小鼠Ast激活后产生的TNF-α和IL-1β甚至能达到对照组的15倍以上。离体情况下,KSRP-/-Ast条件性培养液有趋化作用且能诱导神经元死亡。令人惊讶的是,笔者发现仅通过特定途径激活Ast后才能观察到部分mRNA半衰期延长。荧光素酶报告系统研究显示KSRP可在转录水平和转录后水平调节细胞因子基因的表达。本研究提示KSRP在促炎介质的调控方面发挥重要作用,因此在CNS炎性和自身免疫性疾病中有广泛意义。

大动脉炎患者外周血单个核细胞RT-qPCR内参基因的选择

目的筛选适于在大动脉炎(TAK)患者和健康人群(HC)之间比较外周血单个核细胞(PBMC)中mRNA表达水平的内参基因。方法提取PBMC中的总RNA,应用RT-qPCR,分别采用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种软件程序,分析β-glucuronidase、GAPDH、ACTB、SDHA、HPRT1、RPL13A、B2M、YWHAZ和PKG19个基因的mRNA表达稳定性。以T-bet、GATA3和RORC作为目的基因,比较不同稳定性的内参基因对mRNA相对丰度的影响。结果geNorm筛选得到的基因组合为B2M-SDHA,NormFinder和BestKeeper筛选出最稳定的内参基因均为HPRT1;3种方法均显示GAPDH的稳定性较差。结论自身免疫病患者在接受免疫抑制药物治疗时,原本稳定表达的基因可能会上调或下调;在样本量较小时,稳定性更好的内参基因可能更有助于检测组间差异。

加热灭活对荧光定量逆转录PCR检测新型冠状病毒RNA影响分析

56℃处理30min能有效灭活新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。但加热处理对后继的荧光定量RT-PCR检测有无影响尚未见报道。本研究使用已知SARS-CoV-2核酸检测阳性的5个咽拭子标本,各自分为4份:对照组、56℃30min、56℃45min和56℃60min处理组。热处理后提取核酸并使用荧光定量RT-PCR检测病毒RNA相对含量。结果显示,56℃处理30~60min会导致荧光定量RT-PCR检测病毒核酸降低40%左右。56℃30min、56℃45min和56℃60min处理组间检测结果无统计学差异(P>0.05)。本研究提示,SARS-CoV-2标本56℃30min灭活后,再进行核酸提取和荧光定量RT-PCR检测,能更好地保护实验操作过程中人员和环境的安全。加热灭活对荧光定量RT-PCR检测结果的影响有限,但对于结果在临界值附近的标本应慎重使用。

异基因造血干细胞移植后恶性血液病患者新增加染色体核型异常的研究

目的探讨异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）前后恶性血液病患者染色体核型的变化规律及其在allo—HSCT预后监测中的意义。方法回顾性分析21例allo—HSCT后复发的恶性血液病患者初诊和复发时的染色体核型资料，并结合临床进行相关性分析。染色体检查采用24h短期培养R显带技术。结果21例恶性血液病患者中11例（52．38％）患者allo—HSCT后复发时染色体核型发生改变，多见于1…3612、17、21号等染色体，而且染色体数目和结构异常多同时出现。移植复发时染色体核型出现改变的患者移植复发中位生存时间显著短于未出现改变的患者（79d对522d，P=0．027）。出现6号染色体三体的患者比未出现该改变患者的移植复发中位生存时间明显缩短（9d对275d，P=0．005）。结论allo—HSCT后患者复发时染色体核型的改变与预后有关。