微小RNA-543靶向调控RNA结合蛋白47促进胃癌细胞的增殖和转移

目的探究微小RNA-543(miR-543)通过抑制RNA结合蛋白47(RBM47)对胃癌细胞增殖和转移的影响和机制。方法荧光实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测40例新鲜胃癌和癌旁组织中miR-543表达;检测正常胃上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株MKN45、NCIN87、AGS中miR-543的表达。分析miR-543表达与临床病理特征之间的关系。生物信息学分析miR-543的生物学功能和靶基因。双荧光素酶报告基因分析miR-543和靶基因RBM47之间调控关系。应用miR-543抑制物(inhibitor)干扰胃癌AGS细胞株中miR-543表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法、划痕实验、Transwell小室实验检测胃癌细胞株AGS增殖、侵袭、迁移能力;RT-qPCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测AGS中人细胞周期素D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、RBM47、组织抑制剂1(TIMP1)表达。数据应用SPSS 25.0统计软件分析。结果miR-543在胃癌组织中(2.476±0.812)的表达高于癌旁组织(1.165±0.295,t=9.880,P<0.01),在胃癌细胞株中的表达均高于GES-1(1.130±0.141,t=9.842,P<0.05;t=13.17,P<0.01;t=35.07,P<0.01),miR-543在AGS细胞株中表达量最高(5.120±0.545)。miR-543表达与胃癌患者淋巴结转移有关(阳性例数:27)。富集分析结果显示miR-543与多种生物学过程有关,RBM47基因是miR-543下游靶基因。RBM47基因在胃癌组织中表达(0.663±0.251)低于癌旁正常组织(1.604±0.613,P<0.01),相关性分析结果显示RBM47基因与miR-543负相关(r=-0.724),双荧光素酶报告基因分析miR-543直接抑制RBM47表达。用miR-543 inhibitor转染AGS后,胃癌细胞增殖、侵袭、迁移能力明显下降(P<0.01);Cyclin D1、MMP-9的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),而RBM47、TIMP1的表达明显增高(P<0.01)。结论miR-543可通过抑制RBM47表达促进胃癌细胞的增殖和转移能力。

miR-205-5p对RBM47的调控作用及对食管鳞癌细胞侵袭迁移的影响

目的探讨微小RNA-205-5p(miR-205-5p)对RNA结合蛋白47(RBM47)的调控作用,及对食管鳞癌细胞侵袭迁移的影响。方法取人食管鳞状细胞癌细胞系(TE14和KYSE70)和人食管上皮细胞(HET-1A),实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组细胞miR-205-5p、RBM47 mRNA表达水平。取KYSE70细胞,分为空白对照组、miR-205-5p抑制剂(miR-205-5p-inhibitor)组、miR-205-5p抑制剂阴性对照(miR-205-5p-NC)组、RBM47过表达腺病毒(Ad-RBM47)组、Ad-RBM47阴性对照(Ad-eGFP)组。RT-qPCR检测各组细胞miR-205-5p、RBM47 mRNA表达水平;用CCK-8法检测各组细胞增殖活性;Transwell小室法检测细胞迁移侵袭能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测各组细胞RBM47、侵袭迁移相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)及锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)。双荧光素酶活性实验验证miR-205-5p与RBM47的靶向关系。将miR-205-5p-inhibitor与RBM47干扰载体(si-RBM47)及空载体(si-RNA-NC)共转染,分为miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组、miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组、miR-205-5p-NC+si-RBM47组、miR-205-5p-NC+si-RNA-NC组、未转染组(空白对照组),并检测各组细胞转染后侵袭迁移能力。结果与HET-1A细胞系相比,ESCC细胞系(TE14和KYSE70)中miR-205-5p表达升高(P<0.05),RBM47 mRNA表达降低(P<0.05),在KYSE70细胞系中,miR-205-5p表达最高,RBM47 mRNA表达最低,选用KYSE70细胞系进行后续试验。抑制miR-205-5p或激活RBM47表达后,与空白对照组比较,miR-205-5p-inhibitor组及Ad-RBM47组细胞增殖活性、侵袭迁移能力、ZEB1蛋白表达降低(P<0.05),RBM47、E-cadherin表达升高(P<0.05);miR-205-5p-NC组及Ad-eGFP组上述指标与空白组对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-205-5p-inhibitor与si-RBM47共转染后,与空白组对照组比较,miR-125b-NC+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力升高(P<0.05);miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组细胞侵袭迁移能力降低(P<0.05)。与miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组相比,miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力升高(P<0.05);miR-125b-NC+si-RNA-NC组与空白对照组相比,上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶活性试验显示,与miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT组比较,miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05),miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-MUT组、miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-MUT组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05),miR-205-5p与RBM47有结合位点,且呈靶向负调控作用。结论Escc细胞中miR-205-5p表达升高,RBM47表达降低,下调miR-205-5p表达可抑制Escc细胞侵袭迁移能力,可能与上调RBM47表达有关。