多房棘球蚴RNA结合蛋白EWS的原核表达及其细胞定位与功能的初步鉴定

通过对多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)RNA结合蛋白EWS(EmEWS)基因的原核表达、抗体制备、细胞定位等研究,初步探究EmEWS基因特征以及与RNA的结合能力。根据Wormbase数据库中EmEWS基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增EmEWS基因并构建重组表达质粒,诱导表达、纯化重组蛋白,制备EmEWS多克隆抗体后进行Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光定位、双荧光测定。结果表明,EmEWS基因长度为1485 bp,编码495个氨基酸,在多房棘球蚴原代细胞中表达量较高,在原头蚴中最低。生物信息学分析表明,细粒棘球蚴EWS与EmEWS相似性高达98.3%,且EmEWS的RBD结构域在绦虫中高度保守。EmEWS重组蛋白大小约为54 ku,制备的多克隆抗体可识别多房棘球绦虫中天然EmEWS蛋白。细胞定位显示EmEWS主要分布在细胞膜上。双荧光试验证明EmEWS可以与结合富含UG的RNA序列结合。综合上述结果,推测EmEWS可能作为转录调控因子参与小RNA的形成,同时有助于核蛋白的运输。

冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因的筛选及验证

目的筛选冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞关键RNA结合蛋白基因,并对其进行验证。方法①冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因筛选选择冠状动脉粥样硬化患者5例(观察组)、健康志愿者5例(对照组),采用转录组测序技术检测外周血单个核细胞RNA转录组,运用R软件“edgeR”包筛选P<0.05、|logFC|>1、错误发现率<0.05的单个核细胞差异表达基因。从RNA结合蛋白数据库中下载人单个核细胞的RNA结合蛋白相关基因资料,与外周血单个核细胞差异表达基因取交集后获得冠状动脉粥样硬化单个核细胞RNA结合蛋白相关差异表达基因。运用TopHat2、ABLas软件筛选冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞差异表达RNA结合蛋白相关基因的可变剪接事件。筛选相对表达量最高的单个核细胞RNA结合蛋白相关差异表达基因为关键RNA结合蛋白基因。②冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因验证另选取冠状动脉粥样硬化患者10例(一组)、健康志愿者10例(二组),抽取外周静脉血后分离外周血单个核细胞,采用qRT-PCR法检测2组RNA结合蛋白关键基因。从GEO数据库(GSE40231、GSE43292、GSE100927、GSE27034)数据集中,检索冠状动脉粥样硬化患者、健康志愿者外周血单个核细胞RNA结合蛋白关键基因表达资料。结果冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞的差异RNA结合蛋白相关基因有:过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α、锌指RNA结合蛋白2、SAM域、SH3域和核定位信号1(SAMSN1)、肝配蛋白A型受体2、RNA结合基序蛋白24、多种剪接形式的RNA结合蛋白2、SH3和多个锚蛋白重复结构域1。与对照组相比,观察组患者单个核细胞RNA结合蛋白相关基因的可变剪接事件多(P<0.05)。关键RNA结合蛋白基因为SAMSN1。与二组相比,一组患者外周血单个核细胞SAMSN1相对表达量升高(P<0.05)。GEO数据库数据结果显示,相比于健康志愿者,冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞单个核细胞SAMSN1相对表达量升高(P<0.05)。结论冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞关键RNA结合蛋白基因为SAMSN1基因。相比于健康志愿者,冠状动脉粥样硬化患者单个核细胞SAMSN1基因表达升高,可变剪接事件增多。SAMSN1基因可能通过调控RNA结合蛋白相关基因的可变剪接事件,参与冠状动脉粥样硬化的发生发展。

抑制lncRNA TUG1下调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1炎症小体在延缓阿尔茨海默病进展的作用

目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)抑制核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎症小体在缓解阿尔茨海默病进展中的作用。方法选取9~10周龄遗传背景为C57/BL6的野生型小鼠(WT组,10只)或淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠(30只)。APP/PS1转基因小鼠随机分为模型(model)组,模型+敲低lncRNA TUG1组[model+lncRNA TUG1短发夹RNA(shRNA)组]和model+shRNA非靶标(NT)组,每组10只。分别采集12周龄第1天(3月龄)和32周龄第1天(8月龄)小鼠外周血和脑皮质组织,并分离皮质中的原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞,每个时间点每组5只小鼠。Real-time PCR分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的水平,以及原代星形胶质细胞中补体蛋白C1r和C1s mRNA的水平。ELISA法测定其外周血浆中MIF含量。对3月龄和8月龄小鼠脑皮质原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞共培养。CCK-8法测定上述2种细胞的增殖能力。Western blotting分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织中MIF、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1及NLRP3蛋白的表达水平。采用免疫荧光染色法测定8月龄各分组小鼠脑皮质组织中β淀粉样蛋白(Aβ)表达。结果3月龄和8月龄时,与WT组小鼠相比,model组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF相对表达水平显著上调,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF的相对表达水平显著降低,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力降低(P<0.05)。与WT组相比,model组小鼠外周血浆中MIF含量显著升高;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1以及NLRP3的蛋白表达水平显著升高;Aβ免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠外周血浆中MIF含量显著降低;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)和NLRP1的蛋白表达水平显著降低,Aβ免疫荧光强度明显降低(P<0.05),而NLRP3蛋白质的表达水平无明显变化(P>0.05)。与model组相比,model+shRNA NT组小鼠上述所有检测指标差异均无显著性(P>0.05)。结论APP/PS1转基因小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF因子表达上调与脑皮质内NLRP1炎症小体激活成正相关,敲低lncRNA TUG1可缓解阿尔茨海默病的进展。

RNA结合蛋白HuR调控lncRNA DLEU2促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭的机制

目的探讨RNA结合蛋白人抗原(Hu)R对食管鳞癌细胞增殖、侵袭的影响及其与长链非编码RNA(lncRNA)淋巴细胞白血病缺失基因(DLEU)2的调控关系。方法收集食管鳞癌组织样本并在体外培养正常人食管鳞状上皮细胞Het-1A及食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验检测HuR mRNA与DLEU2表达水平。利用Lipofectamime2000试剂对KYSE30细胞进行转染,并随机分组为对照组、pcDNA组、pc-HuR组、sh-NC组、sh-HuR组、sh-HuR+si-NC组和sh-HuR+si-DLEU2组。CCK-8法检测各组KYSE30细胞活性;平板克隆形成实验检测各组KYSE30细胞增殖能力;荷瘤裸鼠实验观察体内肿瘤生长情况;Transwell小室检测各组KYSE30细胞侵袭能力;Western印迹检测各组KYSE30细胞中HuR蛋白表达水平;RNA免疫沉淀(RIP)实验分析HuR与DLEU2的结合关系。结果在食管鳞癌组织和细胞系中,HuR mRNA和蛋白表达及DLEU2水平均显著升高(P<0.05),其中KYSE30细胞系中HuR基因与DLEU2表达水平最高,故选择KYSE30细胞进行转染实验。转染pc-HuR的细胞中HuR蛋白表达明显上调,细胞活性、克隆形成率及细胞侵袭数均显著增加(P<0.05);转染sh-HuR的细胞中HuR蛋白表达明显下调,细胞活性、克隆形成率及细胞侵袭数均显著降低(P<0.05)。RIP实验和qRT-PCR检测发现HuR与DLEU2有相互作用关系。同时转染sh-HuR和si-DLEU2的细胞中DLEU2水平明显降低,细胞活性、克隆形成率及细胞侵袭数均比转染sh-HuR明显更低(P<0.05)。过表达HuR显著增加移植瘤体积和重量,抑制HuR明显减小移植瘤的体积和重量,而同时抑制HuR和DLEU2时移植瘤的体积和重量比单独抑制HuR时明显更小(P<0.05)。结论HuR通过与DLEU2结合,促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和移植瘤的体内生长。

RNA结合蛋白在慢性肾脏病中的研究进展

当前慢性肾脏病已成为一个全球的公共健康问题而受到关注。我国慢性肾脏病的发病率呈逐年升高趋势,其发病机制复杂、病情缓慢迁延、并发症多等因素成为临床诊治的难题,如不能有效防治将成为沉重的社会和经济负担。随着对RNA结合蛋白的研究不断深入,发现其与慢性肾脏病的发生、发展密切相关。本文对RNA结合蛋白与各种慢性肾脏病间的作用机制进行综述,以期为慢性肾脏病的临床诊断、治疗及预后提供新的方向。

采用MS2 pulldown和质谱分析法检测BT549细胞中的LncRNA SNHG15结合蛋白

目的:鉴定乳腺癌BT549细胞中与长链非编码RNA SNHG15结合的蛋白。方法:用慢病毒感染乳腺癌BT549细胞,构建稳定过表达SNHG15的BT549-SNHG15-MS2细胞株。通过MS2 pulldown和质谱分析法,检测BT549细胞中与SNHG15结合的蛋白。随后采用RNA免疫共沉淀(RIP)和逆转录-定量PCR(RT-qPCR)法,以HEAD框肽5(DEAD box helicases 5,DDX5)为模板验证共沉淀蛋白和SNHG15的结合。结果:经MS2 pulldown和质谱分析筛选出386个潜在的SNHG15结合蛋白。RNA免疫沉淀结合RT-qPCR检测结果证实DDX5与SNHG15的结合。结论:本研究介绍了一种有效分析RNA-蛋白质相互作用的生物学方法,同时为深入研究SNHG15的作用机制提供了新的实验证据。

水稻双链RNA结合蛋白同源基因OsRBP的克隆及其表达的分析

在基因数据库中发现两个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域 (dsRBD)有同源的区域 ,根据同源片段的位置特征设计引物 ,用RT-RCR扩增粳稻 (Oryzasativasubsp .japonica)愈伤组织的cDNA ,得到大小为 1.8kb的DNA片段。该cDNA片段含完整的编码区 ,有两个典型的dsRBD ,分别与BcpLH的dsRBD在氨基酸水平上同源性为 75 %左右 ,故将其命名为OsRBP。RT -PCR表达分析显示该基因在未成熟的种子和愈伤组织中表达 ,在根、茎、叶、穗、成熟种子及胚芽鞘中没有表达信号 ,由此推测该基因的表达可能与种子和胚的早期发育相关。该研究首次从水稻中分离到双链RNA结合蛋白基因 ,并初步研究了其表达方式 。

刚毛柽柳富含甘氨酸RNA结合蛋白ThGRP1基因克隆与表达分析

在有机体的生长和发育过程中,基因表达在转录、转录后和翻译水平都受到严格地调控。转录调控是基因表达调控的第一步,曾被认为是基因表达的主要调控机制,但是随着对转录后调控机制越来越多的了解，发现转录后调控在基因表达调控中同样起着重要作用。转录后的调控决定着基因表达最终产物的种类和表达量。转录后水平的基因表达调控主要是通过RNA结合蛋白（RBPs）直接完成，或通过RBPs控制其它转录因子间接完成的。

寒冷环境下民猪冷诱导RNA结合蛋白基因的表达变化

为了研究民猪冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因组织表达及寒冷环境下表达变化情况,试验采用RT-PCR和Real-time PCR的方法检测CIRP基因在民猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌等器官组织中的表达情况以及寒冷环境下在肌肉中的表达变化情况。结果表明:常温下CIRP基因在所检测的7个器官组织中均有表达,呈组成型表达;寒冷环境下CIRP基因在民猪背最长肌中表达水平显著升高(P<0.05)。

玉米RNA结合蛋白GRMZM2G052926基因的生物信息学分析

为了研究玉米RNA结合蛋白在玉米生长发育中的调节机制,以一个玉米RNA结合蛋白GRMZM2G052926基因为材料,采用生物信息学的方法,对其理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、功能域、二级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:基因包含一个1 335bp开放阅读框,是一种具有亲水能力的不稳定酸性蛋白,相对分子质量38.301 1kDa,包含两个RRM超亲家族(RRM superfamily),无信号肽序列,无跨膜结构域,亚细胞定位在细胞质上,二级结构由无规则卷曲、α螺旋、延伸链和β折叠构成;系统进化树分析表明,GRMZM2G052926蛋白与水稻Os05g0437300蛋白亲缘关系最近,同源性达到87%。

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。

肺腺癌组织中RNA结合基序蛋白38和p53基因的表达及其临床意义

目的:分析肺腺癌组织中RNA结合基序蛋白38基因(RNA-binding motif protein 38,RBM38)及抑癌基因p53 m RNA和蛋白的表达情况,探讨其在肺腺癌发生发展中的意义。方法:取2012年10月至2015年6月新疆医科大学附属肿瘤医院收治的50例肺腺癌患者的肿瘤组织标本作为实验组,相对应的癌旁组织标本作为对照组。用RT-PCR法检测两组中RBM38及p53m RNA相对表达量,用Western blotting法检测两组中RBM38及p53蛋白的相对表达量。结果:实验组RBM38 m RNA及蛋白相对表达量(0.357±0.170、0.294±0.149)均高于对照组(0.271±0.128、0.206±0.099),实验组p53 m RNA及蛋白(0.457±0.208、0.671±0.200)相对表达量均高于对照组(0.308±0.167、0.332±0.071),差异均有统计学意义(均P<0.01)。RBM38表达与肺腺癌患者TNM分期、浸润深度有关(P<0.05),p53表达与患者TNM分期有关(P<0.05)。实验组RBM38与p53蛋白表达呈负相关(r=-0.626,P<0.01)。结论:肺腺癌组织RBM38、p53 m RNA及蛋白表达均高于癌旁组织,两者均与患者TNM分期等病理参数关系密切。随着RBM38蛋白表达的增加p53蛋白随之减少,RBM38可能通过抑制p53的翻译从而促进肺癌的发生发展,RBM38可能成为肺腺癌分子靶向治疗的靶点。

外泌体相关RNA结合蛋白基因通过参与先天免疫对肝细胞癌发展的可能性影响研究

目的:探讨外泌体相关RNA结合蛋白在肝细胞癌(HCC)中的可能功能。方法:对肿瘤微环境(TM)和生理微环境(PM)组织进行RNA测序(RNA-seq)和生物信息学分析,探讨外泌体相关RNA结合蛋白差异表达基因的生理功能,并用RT-qPCR验证实验结果。结果:在TM和PM之间发现69个参与免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白差异表达基因。经功能富集显示,它们共参与了12个生物学程序(BP)、4个细胞组分(CC)、1个信号通路(KEGG)和3个蛋白位点序列特征(UP-SEQ)。进一步分析发现,功能主要聚集在免疫应答,尤其是先天免疫,还有参与补体激活经典途径、炎性反应等。另外引起基因多态性的SNV分析发现,这些差异表达基因的SNV与基因表达呈负相关。结论:在TM和PM中外泌体相关RNA结合蛋白基因存在差异表达,生物信息学显示其可能涉及到多个生物学过程,且可能通过参与先天免疫影响HCC发展。

重组BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白CIRP多克隆抗体的制备与鉴定

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中被发现的冷休克蛋白,伴随着细胞冷应激过程过量表达.为进一步研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP的生物学功能,构建重组BALB/C鼠CIRP的原核表达载体,重组BALB/C鼠CIRP蛋白经NI-NTA亲和树脂纯化后免疫獭兔制备抗CIRP多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot检测抗体效价和抗原特异性.本实验成功构建了CIRP的原核表达载体,在E. coli XL-1-blue得到了高效表达,利用原核表达包涵体蛋白免疫獭兔获得了高效价的CIRP多克隆抗体,该抗体能识别肝脏和睾丸中天然的CIRP蛋白.

LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT在糖尿病肾病患者中的表达及与肾功能的相关性研究

目的探究长链非编码RNA锌指E盒结合同源盒蛋白1反义链1(LncRNA ZEB1-AS1)和长链非编码RNA性别决定相关基因簇2重叠转录本(LncRNA SOX2OT)在糖尿病肾病(DN)患者中的表达及与肾功能的相关性。方法选取于2021年11月—2023年12月在武汉大学人民医院肾内科收治的DN患者106例为DN组,并根据24 h尿蛋白定量(24 h Upro)水平分为正常蛋白尿亚组43例(<30 mg)、微量蛋白尿亚组39例(30~<300 mg)、大量蛋白尿亚组24例(≥300 mg),另选取同期医院单纯糖尿病患者106例作对照组,检测患者血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平;Pearson法分析LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT与肾功能指标的相关性;Logistic分析影响DN患者肾功能损伤的因素。结果DN组血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平低于对照组(t=11.471、10.257,P均<0.001)。血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT比较,正常尿蛋白亚组>微量尿蛋白亚组>大量尿蛋白亚组(F=58.720、117.722,P均<0.001),BUN、SCr、UA水平比较,正常尿蛋白亚组<微量尿蛋白亚组<大量尿蛋白亚组,差异均有统计学意义(F=122.493、595.589、53.178,P均<0.001);LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT分别与BUN、SCr、UA呈负相关(r=-0.487、-0.498、-0.521,-0.527、-0.515、-0.534,P均<0.001);Logistic回归分析显示,糖尿病病程长及高BUN、SCr、UA水平是影响DN患者肾功能损伤的危险因素[OR(95%CI)=1.672(1.128~2.479)、2.839(1.534~5.253)、2.754(1.512~5.017)、2.693(1.464~4.954)],高LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT是保护因素[OR(95%CI)=0.875(0.798~0.959)、0.898(0.832~0.969)]。结论血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平与DN患者肾功能有关,可能是评估DN患者肾功能的潜在指标。

家蚕AGO1蛋白结合RNA的分离与鉴定

RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)核心蛋白为Argonaute(AGO)家族蛋白,作为miRNA及RNAi功能途径中的关键蛋白,能够结合miRNA和siRNA,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。因此,利用AGO蛋白抗体通过免疫沉淀分离其结合RNA是目前规模化分离鉴定miRNA及相关小RNA靶基因的重要方法。首先对家蚕AGO1基因进行克隆表达和抗体制备,用自制的兔多克隆抗体免疫沉淀家蚕组织内源BmAGO1蛋白,成功分离BmAGO1蛋白结合的RNA;同时在BmN细胞中采用6×His标签融合表达BmAGO1蛋白,用His单抗免疫沉淀His-BmAGO1蛋白,同样成功分离获得其结合RNA。qRT-PCR检测发现,BmAGO1蛋白结合的RNA中含有家蚕miRNA靶基因BmEm4的mRNA。研究结果为批量鉴定家蚕miRNA靶基因奠定了基础,同时也为深入研究BmAGO1蛋白在家蚕中的功能提供了依据。

抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选

目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。

ARHI基因mRNA和蛋白表达水平与胶质瘤恶性度相关性探讨

目的探讨ARHI基因表达水平与人脑胶质瘤恶性度的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot法检测10例正常脑组织、59例胶质瘤组织、4种胶质瘤细胞系(U251,SHG44,BT325,U87)中ARHI基因mRNA和蛋白的表达强度,结合临床病理资料统计分析。结果胶质瘤组织、细胞系中ARHI基因的表达水平显著低于正常脑组织,胶质瘤组织中ARHI的表达水平随肿瘤恶性程度增加而明显降低(P<0.01)。结论 ARHI基因mRNA和蛋白在胶质瘤中低表达,且表达水平与胶质瘤恶性程度负相关,提示ARHI基因低表达对胶质瘤的形成和恶性演变具有重要作用。

植物RNA结合蛋白的研究进展

从RNA结合蛋白的鉴定方法,RNA结合蛋白的基序,以及植物RNA结合蛋白在调控叶绿素mRNA的稳定和转录、植物抗逆反应、开花和激素信号传导等过程中的作用等方面介绍了植物RNA结合蛋白的研究进展。

大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定

目盼构建大鼠CREB结合蛋白（CREB binding protein，CBP）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，并观察该载体对大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）CBP表达的沉默效应。方法设计合成4条CBP基因的siRNA序列，将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU—GW—iRNA载体连接产生CBPshRNA慢病毒表达载体，转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞，完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs，实时定量RT-PCR检测CBP mRNA的表达，并与未转染及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞进行比较。结果PCR扩增和测序结果证实，成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×10^9TU／ml，与未转染慢病毒及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞比较，CBP shRNA慢病毒转染可使VsMcs的CBP mRNA分别下降88．5％和92．7％。结论成功构建CBP基因RNAi慢病毒表达载体．对VsMcs的CBP表达具有良好沉默作用，为后期基因治疗血管增殖性疾病奠定基础。