RNA聚合酶Ⅱ启动子调控RNA干扰在肿瘤治疗中的应用前景

RNA干扰是双链RNA介导的特异性转录后基因表达沉默现象.由于双链小干扰RNA介导的RNA干扰技术设计简便、作用迅速、效果明显,目前已被广泛应用于基因功能和重大疾病治疗的研究,尤其为肿瘤治疗提供了一条新途径.利用RNA干扰技术通过调节肿瘤发生发展相关基因的表达可制定出一系列有效的抗癌策略.然而在现行大多数策略中往往采用不可调控的RNA聚合酶Ⅲ启动子(H1,U6)表达经典的发夹结构RNA,经由Dicer酶切割成功能性siRNA,因此缺乏组织细胞靶向性和抗癌效率.最新研究表明,采用RNA聚合酶Ⅱ启动子可弥补由RNA聚合酶Ⅲ启动子调控RNA干扰缺陷和不足.此外,运用病毒载体特别是具有靶向和溶瘤效应的肿瘤特异性复制腺病毒,介导RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达siRNA有望成为更有效的治疗手段.

非完全互补shRNA对RNA聚合酶Ⅱ启动子调控的RNAi的影响

RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默技术,可有效诱导序列特异性基因沉默.由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA可有效介导RNAi效应,为组织特异性基因沉默提供了一条新的途径.但是,由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA(shRNA)在序列上与靶基因非完全互补对RNAi效应的影响鲜有报道.本文初步探索RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的shRNA碱基发生突变或缺失对RNAi效应的影响.研究表明,靶向hTERT mRNA的碱基突变shRNA显著降低RNAi效应,而靶向GFP mRNA的碱基缺失shRNA对RNAi效应没有显著影响.本研究为非完全互补shRNA对RNAi效应的进一步深入研究提供了理论与实验依据.

真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的计算机预测

启动子是基因组序列中靠近基因转录起始位点的区域,是影响基因表达的重要功能单位之 一。除实验方法发现或验证序列的启动子外,现已经有多种启动子序列的计算机预测方法,如位点比重 阵列(PWM)、隐马尔柯夫模型(HMM)、神经网络、低聚复合物和CpG岛等。本文综述了现有真核生物基 因启动子序列的生物信息研究技术。

RNA聚合酶Ⅱ启动子近端暂停/释放的动态调控及生理作用研究进展

基因表达的精确时空调控对生物体的发育和生存至关重要。在多数后生动物中,RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)在发育和应激反应相关基因的启动子近端区域暂停,一旦受到环境或发育信号的刺激,RNAPⅡ从启动子近端向基因体(genebody)释放,进行有效延伸。RNAPⅡ在基因转录起始位点下游近端区域的暂停/释放是基因转录过程的必要环节,也是基因表达调控的关键步骤,与基因表达时空调控及多种人类疾病密切相关。综述了参与RNAPⅡ启动子近端暂停的维持和释放的调控机制的研究进展,重点探讨了其在机体发育的重要调控作用及其与其他基因调控机制的联系,并展望了RNAPⅡ启动子近端暂停与释放研究中的潜在问题和未来研究方向,以期为进一步解析RNAPⅡ启动子近端暂停与释放的调控机制及其在发育中的作用提供线索。

polo样激酶1、RNA聚合酶Ⅱ亚基A在人脑胶质瘤中的表达及与预后的关系

目的 探讨polo样激酶1(PLK1)、RNA聚合酶Ⅱ亚基A(POLR2A)在人脑胶质瘤(BG)中的表达及与预后的关系。方法 选取86例BG患者作为观察组,另选取30例非肿瘤脑疾病患者作为参照组,收集观察组患者的BG组织和参照组患者的非肿瘤脑组织。比较两组患者PLK1、POLR2A表达情况和不同临床特征BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A的阳性表达情况;比较不同PLK1、POLR2A表达情况BG患者的生存情况;采用Cox回归模型分析BG患者预后的影响因素。结果 观察组患者PLK1、POLR2A阳性表达率分别高于参照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。低分化BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A阳性表达率均高于中高分化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。PLK1、POLR2A阳性表达患者的中位生存时间均明显短于PLK1、POLR2A阴性表达患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Cox多因素回归分析结果显示,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素(P﹤0.05)。结论 BG患者PLK1、POLR2A呈高表达,PLK1、POLR2A高表达BG患者中位生存时间缩短,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素。

RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动的长双链RNA干扰载体的构建与验证

为了探索构建由RNA聚合酶Ⅱ型启动子驱动、能有效避免干扰素反应的表达长双链RNA的RNA干扰载体,试验在转录单元两端各添加了一个自剪切核酶序列,在转录后切成RNA出核所必要的5'帽子和3'polyA尾,以绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因插入2个核酶之间作为试验载体,以表达红色荧光蛋白基因的载体作转染效率校准,通过瞬间转染对荧光蛋白的表达情况进行观察和RT-PCR分析。结果表明:在转染效率基本一致的情况下,试验组未观察到绿色荧光;2个核酶能够完全自剪切,试验组细胞质中有EGFP mRNA的存在,但与正常对照组相比下降了46.1%。说明研究设计的载体达到了延迟表达RNA出核的目的,为用该载体表达长双链RNA时在其出核之前被Dicer酶有效切割成小双链RNA从而避免其出核引起干扰素反应提供了时间保障。

RNA聚合酶Ⅱ启动子SMP8在活化肝星状细胞中的活性

我们已往的研究已经证实，RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）载体表达的针对TGF β1的核酶，在体外能有效逆转活化HSC的生物学活性。但TGFD1是广泛存在于各种细胞中，并发挥重要生物学效应的细胞因子，因此不具组织和细胞特异性的pol Ⅲ启动子核酶表达系统，在抑制HSC活化的同时会影响到正常肝细胞或其他细胞的功能，这使得基因治疗肝纤维化变得困难。为达到靶向性治疗肝纤维化的目的，我们探讨了在活化HSC中特异性激活的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子SMP8的生物学活性，研究其内含子1中CArG[CC（A／T）6GG]顺式作用元件对HSC中SMP8特异性启动子活性的影响，为下一步改造该启动子中的内含子1，使其作为靶向性基因治疗载体的启动子提供实验依据。

启动子的Inr元件及真核RNA聚合酶Ⅱ的转录

真核生物有三类核RNA聚合酶,分别负责真核细胞内三类基因的转录,其中RNA聚合酶Ⅱ负责包括编码蛋白的基因在内的Ⅱ类基因的转录。一般认为。

RNA聚合酶Ⅱ启动子近端暂停的动态调控

转录暂停是一种进化上保守的、从细菌到人类普遍存在的关键转录调控机制.在多数后生动物中,转录起始后, RNA聚合酶Ⅱ在发育和应激反应相关基因的启动子近端区域暂停,一旦受到环境或发育信号的刺激, RNA聚合酶Ⅱ从启动子近端向基因体释放,进行有效延伸. RNA聚合酶Ⅱ启动子近端暂停是转录的关键限速步骤之一,并作为转录早期检验点确保转录进程的正确运作.转录暂停和延伸调控异常与肿瘤及多种人类疾病密切相关.本文系统地从RNA聚合酶Ⅱ启动子近端暂停的建立、维持和释放等方面综述了对于这一重要转录限速步骤的调控,着重讨论了相分离通过浓缩和传递转录相关因子在调控Pol Ⅱ暂停和延伸过程中的作用,并展望了针对转录暂停和释放这一过程设计靶向性治疗策略的潜力.

水牛RNA聚合酶III启动子的克隆与鉴定

【目的】获得有效的水牛RNA聚合酶III启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础。【方法】通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况。【结果】克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守。连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82%和87.45%;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P<0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P>0.05)。【结论】水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性。

不同来源RNA聚合酶对霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用

目的:研究不同来源的RNA聚合酶对预测的霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用。方法:以含有预测的VP3启动子区的片段取代质粒pRL-null的T7启动子区,以海肾萤光素酶基因Rluc为报告基因,在霍乱弧菌N16961内检测霍乱弧菌RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用;将上述重组质粒和表达VP3 RNA聚合酶的质粒共转化大肠杆菌JM109,检测大肠杆菌和VP3的RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用。结果:N16961的RNA聚合酶不能识别并作用于启动子P1、P2、P5、P6、P10和P12,JM109的RNA聚合酶可能识别并作用于启动子P7和P11;只有P2、P7、P8、P9、P13、P16和P17在JM109内可以被克隆表达的VP3 RNA聚合酶识别转录。结论:宿主菌N16961与非宿主菌JM109的RNA聚合酶识别转录VP3启动子的能力不同,可能与噬菌体的宿主特异性有关;VP3的RNA聚合酶对大部分有活性的VP3启动子具有直接启动转录作用,但部分启动子可能需要VP3或宿主蛋白的辅助作用才能表现出更强的活性;VP3启动子对VP3 RNA聚合酶的特异性也不同,P1、P2和P12对VP3的RNA聚合酶具有高度特异性,P7和P11的特异性较弱。

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶 启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。

链霉菌RNA聚合酶的异质性和启动子的多样性

<正>链霉菌是革兰阳性好氧土壤细菌,其生活周期涉及到一个复杂的形态分化过程,包括孢子发芽、营养菌丝生成、气生菌丝形成和孢子生长.链霉菌的基因组大约为8×10~6~1×10~7个碱基对,相当于大肠杆菌的2倍多,其DNA含有异常高的GC比(约为73%),并有证据表明,染色体的线性形式在链霉菌中很普遍.在链霉菌中,从形态分化到次级代谢过程无不为一个复杂的、常常是相互偶联的多层次调控系统所支配.这些调控层次包括:启动子和RNA鄹合酶的多样性,阻遏作用,活化作用,感受器/响应器调控系统,ppGpp系统,调控tRNA系统,以及被誉为细菌激素的丁羧内酯类化合物系统.许多异源基因,包括人的白细胞介素2(IL-2),牛的生长激素,大肠杆菌木糖异构酶基因等,都可在链霉菌中获得表达.高活性启动子的存在往往是外源基因表达的关键.因而,了解有关链霉菌启动子结构与基因表达的关系,对于构建链霉菌分泌表达载体相当重要.

几种不同鹅膏菌毒素对真核生物RNA聚合酶Ⅱ抑制作用的比较研究

用鹅膏菌属（Amanita）含α-毒伞肽的毒素粗提液培养新鲜绿豆，结果在36小时后，各种不同毒苗的毒素粗提液培养的绿豆生长情况有明显不同，用紫外吸收法测定蛋白质含量，发现毒素粗提液培养的绿豆细胞中蛋白质含量比蒸馏水培养的有明显下降，这表明α-毒伞肽的作用机理的确是通过抑制RNA聚合酶Ⅱ而寻致蛋白质合成减少。

RNA聚合酶Ⅱ同BAF复合物和转录因子NF1/CTF之间的联系

通过免疫荧光共定位实验,研究了RNA聚合酶Ⅱ的亚基Rpb1,Rpb6,Rpb8与BAF复合物和转录因子NF1/CTF在基因转录活动中的联系.实验证实,RNA聚合酶Ⅱ的亚基Rpb1与BAF复合物有联系,Rpb6与BAF复合物联系不紧密,Rpb6与NF1/CTF联系密切,Rpb8与BAF复合物和NF1/CTF有部分联系.免疫沉淀实验也证实RNA聚合酶Ⅱ与BAF复合物和NF1/CTF一同参加了转录起始复合物的形成.

日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的分离和序列分析

目的 分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponisum ,Sj)新基因。 方法 应用表达序列标签 (Expressedse quencetags ,ESTs)法随机筛选SjcDNA文库 ,通过PCR直接序列测定技术和同源性比较对阳性插入片段进行鉴定。采用亚克隆技术和生物信息学分析对日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录延长因子SⅢ -p15亚单位进行结构和功能的鉴定。结果 我们从SjcDNA文库中随机筛选到一个cDNA克隆 ,它含有一个 371个碱基组成的阅读框 ,编码 118个氨基酸 ,与哺乳动物等的RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位具有较高的同源性 ,且具有该因子所特有的氨基酸序列 ,表明我们已经获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位。 结论 获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位的全长cDNA序列 。

鹅膏毒肽与RNA聚合酶Ⅱ相互作用的研究进展

RNA聚合酶Ⅱ是真核生物中最活跃最复杂的RNA聚合酶之一,具有非常重要的生物学功能,而鹅膏(Amanita)毒肽对其活性具有专一的高抑制性,这使鹅膏毒肽与RNA聚合酶Ⅱ相互作用的研究尤为重要。鉴于国内对鹅膏毒肽与RNA聚合酶Ⅱ相互作用的研究薄弱,笔者从鹅膏毒肽活性位点的确定、两者相互作用方式、抑制机理及抑制能力等方面进行总结,以期为两者的深入研究提供参考。

利用Ⅱ型启动子转录的U6 RNA提高植物病毒表达载体在植物中表达外源基因的水平

Ⅱ型启动子转录的外源短链RNA可以竞争性抑制细胞内源mRNA的核质转运,因而可能会提高植物RNA病毒载体表达的外源基因在植物中的积累.为了验证这一假说,利用OE-PCR技术合成拟南芥U6-1核内小RNA序列,并构建其Ⅱ型启动子转录的植物表达载体.以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)表达载体共接种寄主植物本氏烟,通过对报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的荧光观察,并以Western印迹和ELISA测定GFP在烟草中的表达情况,分析共表达Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对外源基因在植物中表达的作用效果.结果表明,共接种Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对TMV病毒表达载体表达外源基因的水平有明显的增效作用,推测RNA核质转运干扰是提高外源基因表达的可能机制.