目的由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究。方法生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法。结果由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了CsRPEF(RNA聚合酶Ⅱ延长因子)基因。通过BLASTX程序同...目的由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究。方法生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法。结果由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了CsRPEF(RNA聚合酶Ⅱ延长因子)基因。通过BLASTX程序同源性比对,显示CsRPEF基因与小鼠和人类的RPEF基因同源性为82%。成功构建了CsRPEF原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行了大规模诱导表达,所表达的GST融合蛋白经蛋白酶原切割后获得CsRPEF重组蛋白。凝胶扫描分析和Bradford法显示,CsRPEF重组蛋白的纯度和浓度分别为85%和(0.73±0.02)mg/ml。将CsRPEF重组蛋白接种至BALB/c小鼠进行免疫实验。间接ELISA法显示免疫小鼠抗体滴度达1∶150。免疫识别结果显示此抗体可识别20 ku CsRPEF重组蛋白和华支睾吸虫20 ku虫源性蛋白。S-P免疫组化方法显示CsRPEF主要定位于华支睾吸虫成虫的表皮、皮下组织和虫卵三部位。CsRPEF新基因序列GenBank的登录号为EU232119。结论CsRPEF基因是防治华支睾吸虫病生物药物研发的重要靶点。展开更多
目的 构建日本血吸虫 RNA聚合酶 转录延长因子 S - p15真核正反义表达载体 ,为进一步鉴定该因子的生物学功能奠定基础。方法 采用表达序列标签法从日本血吸虫成虫 c DNA文库中获得了 1个 RNA聚合酶转录因子 (S - p15 )全长 c DNA序...目的 构建日本血吸虫 RNA聚合酶 转录延长因子 S - p15真核正反义表达载体 ,为进一步鉴定该因子的生物学功能奠定基础。方法 采用表达序列标签法从日本血吸虫成虫 c DNA文库中获得了 1个 RNA聚合酶转录因子 (S - p15 )全长 c DNA序列 ,克隆及序列测定后 ,将该片段正向及反向插入到真核表达载体 pc DNA 3中。重组载体采用氨苄青霉素 L B培养基筛选、双酶切、PCR及测序鉴定。结果 经鉴定 ,S - p15 - pc DNA3真核正反义表达载体构建成功。结论 构建成功 S -p15 - pc DNA3真核正反义表达载体 ,为下一步鉴定其生物学功能奠定基础。展开更多
基金Supported by the national high technology re-search and development program of China(863 Program,No.2006AA02Z422)a grant from the key science and technique programof Guangdong Province(No.2004A30801004)
文摘目的由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究。方法生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法。结果由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了CsRPEF(RNA聚合酶Ⅱ延长因子)基因。通过BLASTX程序同源性比对,显示CsRPEF基因与小鼠和人类的RPEF基因同源性为82%。成功构建了CsRPEF原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行了大规模诱导表达,所表达的GST融合蛋白经蛋白酶原切割后获得CsRPEF重组蛋白。凝胶扫描分析和Bradford法显示,CsRPEF重组蛋白的纯度和浓度分别为85%和(0.73±0.02)mg/ml。将CsRPEF重组蛋白接种至BALB/c小鼠进行免疫实验。间接ELISA法显示免疫小鼠抗体滴度达1∶150。免疫识别结果显示此抗体可识别20 ku CsRPEF重组蛋白和华支睾吸虫20 ku虫源性蛋白。S-P免疫组化方法显示CsRPEF主要定位于华支睾吸虫成虫的表皮、皮下组织和虫卵三部位。CsRPEF新基因序列GenBank的登录号为EU232119。结论CsRPEF基因是防治华支睾吸虫病生物药物研发的重要靶点。
文摘目的 构建日本血吸虫 RNA聚合酶 转录延长因子 S - p15真核正反义表达载体 ,为进一步鉴定该因子的生物学功能奠定基础。方法 采用表达序列标签法从日本血吸虫成虫 c DNA文库中获得了 1个 RNA聚合酶转录因子 (S - p15 )全长 c DNA序列 ,克隆及序列测定后 ,将该片段正向及反向插入到真核表达载体 pc DNA 3中。重组载体采用氨苄青霉素 L B培养基筛选、双酶切、PCR及测序鉴定。结果 经鉴定 ,S - p15 - pc DNA3真核正反义表达载体构建成功。结论 构建成功 S -p15 - pc DNA3真核正反义表达载体 ,为下一步鉴定其生物学功能奠定基础。
