RNA腺苷脱氨酶对社会隔离小鼠攻击行为的缓解作用及5-羟色胺-2C受体机制

目的探讨RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)作用于5-羟色胺-2C受体对社会隔离小鼠攻击行为的缓解作用。方法60只21日龄的健康雄性BALB/c小鼠按照随机数字表法分为6组:社会隔离组、群居对照组、ADAR1诱导剂隔离组、ADAR1抑制剂隔离组、ADAR1诱导剂群居组和ADAR1抑制剂群居组,采用单笼饲养4周方法建立社会隔离模型,采用群居饲养方法作为对照组。ADAR1诱导剂隔离组和ADAR1抑制剂隔离组分别给予ADAR1诱导剂(5.0×10^4U/kg)和抑制剂(10 mg/kg)进行腹腔注射。采用入侵者实验评价小鼠的攻击性行为,免疫组化和蛋白免疫印迹实验检测小鼠脑内ADAR1和5-羟色胺-2C受体的表达变化。结果社会隔离组小鼠的攻击潜伏期明显低于群居对照组[(43.15±6.99)s,(542.40±30.50)s;t=15.906,P<0.01],ADAR1诱导剂隔离组小鼠的攻击潜伏期[(256.70±29.49)s]明显高于社会隔离组(t=7.046,P<0.01),ADAR1抑制剂隔离组小鼠的攻击潜伏期[(15.25±2.18)s]明显低于社会隔离组(t=3.809,P<0.01)。社会隔离组小鼠杏仁核各区ADAR1免疫反应阳性表达细胞的光密度值显著低于群居对照组相应脑区[BLA区:(0.038±0.002),(0.074±0.004);LaDL区:(0.033±0.002),(0.060±0.002);LaVM区:(0.045±0.003),(0.073±0.004);LaVL区:(0.044±0.003),(0.070±0.003);t=8.428,9.037,6.462,5.698,均P<0.01];ADAR1诱导剂隔离组小鼠的杏仁核区ADAR1免疫反应阳性表达细胞的光密度值[BLA区:(0.060±0.003),LaDL区:(0.042±0.002),LaVM区:(0.056±0.004),LaVL区:(0.054±0.003)]明显高于社会隔离小鼠对应脑区,分别为(t=6.055,2.876,2.312,2.492;均P<0.05]。社会隔离组小鼠杏仁核区ADAR1蛋白和5-羟色胺-2C受体蛋白的表达均明显低于群居对照组(t=11.37,12.65;均P<0.01)。ADAR1诱导剂隔离小鼠杏仁核区ADAR1蛋白和5-羟色胺-2C受体蛋白表达均明显高于社会隔离组(t=3.02,4.401;均P<0.05)。结论ADAR1诱导剂可通过增强社会隔离BALB/c小鼠杏仁核5-羟色胺-2C受体的蛋白表达缓解社会隔离BALB/c小鼠的攻击性行为。

脊索瘤中microRNA的差异性表达及其RNA编辑

目的 :检测脊索瘤组织中micro RNA(mi RNA)的差异性表达情况,探讨其RNA编辑。方法 :使用RTq PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)技术检测骶骨脊索瘤组织11种候选mi RNA的表达水平,将其与髓核组织中的表达水平进行比较,对表达异常的mi RNA前体(pri-mi RNAs)的DNA和c DNA序列进行对比,检测是否存在RNA编辑。使用蛋白印迹法(Western blot)检测脊索瘤组织中RNA编辑的关键酶RNA腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADARs)的表达。构建ADAR的表达载体,同时构建ERBB2和HOXA1的3′-非翻译区报告载体并转染mi RNA模拟物和抑制物,将其和ADAR的表达载体共转染至人胚肾细胞293T(HEK293T细胞),用q RT-PCR检测mi RNA的表达水平,并通过荧光素酶报告基因活性分析法对已测得异常表达的mi RNA的靶基因ERBB2和HOXA1进行活性分析,检测ADAR与测得异常表达的mi RNA的靶基因的关系。结果:与髓核组织相比,脊索瘤组织中mi R-10a和mi R-125a的相对表达程度明显下调(P<0.05)。脊索瘤组织中mi R-10a和mi R-125a的前体c DNA序列中出现了腺苷酸向鸟苷酸(A-G)突变,而在髓核组织中mi R-10a和mi R-125a前体的c DNA序列中无此改变,mi R-10a和mi R-125a在成熟过程中出现了A-I RNA编辑。4组脊索瘤组织中有3组存在ADAR1过度表达,2组存在ADAR2过度表达。转染了mi RNA抑制物的HEK293T细胞中ADAR1表达出现上调,而mi R-10a和mi R-125a的表达出现下调,mi R-10a的靶基因ERBB2和mi R-125a的靶基因HOXA1的荧光素酶活性显著增高;相反,转染了mi RNA模拟物的HEK293T细胞中ADAR1表达出现下调,而mi R-10a和mi R-125a的表达出现上调,ERBB2和HOXA1的荧光素酶活性显著降低。结论:ADAR1的过度表达可能通过介导A-I RNA编辑影响mi R-10a和mi R-125a的成熟和表达,参与脊索瘤发生中的细胞异常增殖调控。

RNA编辑酶ADAR1在Huh7.5.1细胞中抑制HCV复制的研究

目的:探究干扰素在Huh7.5.1细胞中对RNA编辑酶(adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1)表达的影响,以及ADAR1对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)复制的调控作用。方法:干扰素(IFN-α,30 IU/m L)刺激Huh7.5.1细胞后,利用real-time PCR和Western blot检测ADAR1表达水平的变化,同时HCV以一定滴度(0.2 MOI)感染Huh7.5.1细胞,观察IFN-α对HCV复制的影响;利用si RNA降低ADAR1表达,过表达质粒(ADAR1 p110和p150)增加ADAR1表达,并进一步利用基因编辑技术建立ADAR1稳定敲除细胞株,明确ADAR1与HCV的复制关系。结果:IFN-α诱导Huh7.5.1细胞ADAR1 p150表达(48 h:t=10.400,P=0.007;72 h:t=19.390,P=0.002),而不影响ADAR1 p110表达(48 h:t=0.806,P=0.472;72 h:t=1.929,P=0.133),同时IFN-α可显著抑制HCV复制(48 h:t=10.170,P=0.001;72 h:t=35.810,P=0.000)。ADAR1 p110和p150过表达48 h后,HCV病毒核酸和蛋白水平均明显低于空白对照(P=0.004,P=0.015);ADAR1 si RNA干扰后,HCV复制增加了2倍以上,差异显著(t=13.530,P=0.000);利用Crispr-cas9技术敲除掉Huh7.5.1中的ADAR1后,HCV复制也明显增加(t=5.259,P=0.023);ADAR1干扰后IFN-α仍然存在对HCV明显的抑制作用(t=9.146,P=0.001)。结论:IFN诱导蛋白ADAR1可以抑制HCV复制,且ADAR1部分介导了IFN-α对HCV复制的抑制。

ADAR1通过RNA编辑上调ZNF655表达并促进人肝癌细胞系HepG2中HBV复制

目的探讨细胞中ADAR1对锌指蛋白ZNF655的作用及其对乙肝病毒(HBV)复制的影响。方法在人肝癌细胞系HepG2细胞中,利用桑格测序验证ZNF655 3'UTR存在ADAR1 RNA编辑位点;RT-qPCR检测ADAR1和ZNF655 mRNA的表达及HBV total RNA和HBV 3.5 kb RNA的表达;双荧光素酶报告基因检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR1和ZNF655蛋白的表达;ELISA检测ZNF655对HBV标志物HBs Ag和HBe Ag的影响。结果 ZNF655基因3'UTR上chr7:99575277位点在DNA水平为纯合型,在RNA水平为杂合型;ZNF655基因3'UTR上chr7:99575277位点的编辑型G比正常型A的荧光素酶活性显著升高(P<0.001);在转录和翻译水平,ADAR1都显著增加了ZNF655的表达(P<0.001);ZNF655对HBV的表达起到促进的作用。结论 ADAR1通过编辑ZNF655的3'UTR上的chr7:99575277位点,使编辑位点A转换成G,上调了基因的表达,进而起到对HBV复制的促进作用。

泛素连接酶SMURF1催化ADAR1的多聚泛素化修饰

既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕获并鉴定THP-1细胞中SMURF1的相互作用蛋白质集合物,发现在THP-1细胞中SMURF1可与222种蛋白质物理性结合,RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)具有较高的肽段结合分数。构建SMURF1过表达载体并转染到HEK-293T细胞中,Co-IP和Western印迹检测验证外源性SMURF1与内源性ADAR1存在相互作用。qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,在HEK-293T细胞中过表达SMURF1后ADAR 1 mRNA水平差异无统计学意义、蛋白质水平明显降低(P<0.05)。用放线菌酮(CHX)分别处理正常和过表达SMURF1的HEK-293T细胞,Western印迹检测显示,过表达SMURF1后ADAR1的半衰期缩短(P<0.05)。进一步在HEK-293T细胞中共转染泛素(Ub)过表达载体和SMURF1过表达载体,通过Co-IP和Western印迹检测结果证实,过表达SMURF1后ADAR1的多聚泛素化水平显著增加(P<0.05)。在蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,Western印迹检测结果表明,蛋白酶体降解途径受抑制后SMURF1对ADAR1的负调控作用减弱(P<0.05)。本研究表明,SMURF1可以与ADAR1相互作用,催化ADAR1的多聚泛素化修饰并介导其蛋白酶体途径降解,为探索SMURF1通过影响ADAR1蛋白质稳定性而具备的多种生物学功能提供理论基础。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ADAR1与IFN-α的相关性及临床意义

目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中RNA腺苷脱氨酶1(ADAR1)与血清IFN-α的表达量,并分析二者的相关性及临床意义。方法选取2019年1-8月于郑州大学第一附属医院风湿免疫科住院治疗的30例SLE女性患者作为SLE组,选取同时期30名健康女性作为对照组,使用定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SLE患者PBMCs中ADAR1 mRNA的相对表达水平。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中IFN-α表达水平。收集临床资料,评估患者的临床症状并计算SLE活动指数(SLEDAI),用SPSS 21.0软件分析ADAR1与IFN-α表达水平、SLEDAI、补体3(C3)、补体4(C4)和24 h尿总蛋白(24 h UTP)的相关性。结果 SLE组血清IFN-α[82.06(46.44,177.63)pg·mL-1](P<0.01)和PBMCs中ADAR1[0.73(0.27,1.54)](P<0.05)表达水平均高于对照组。当血清IFN-α水平<260.0 pg·mL-1时,SLE组PBMCs中ADAR1表达水平与IFN-α水平呈正相关(P<0.05),ADAR1表达水平与SLEDAI (P<0.01)及24 h UTP水平呈正相关(P<0.01),血清IFN-α表达水平与SLEDAI呈正相关(P<0.01),与C3呈负相关(P<0.05)。结论 SLE患者中异常表达的IFN-α可能参与调节ADAR1的表达,PBMCs中的ADAR1或可成为一个评估SLE疾病活动度的潜在生物标志物,为靶向治疗提供了理论基础。

ADAR2通过编辑MAVS基因的3'UTR降低其在细胞中的表达

目的探讨ADAR2在细胞中对线粒体抗病毒信号蛋白MAVS表达的影响及其机制。方法用RT-qRCR检测ADAR家族在细胞中的表达、ADAR2质粒过表达效果以及MAVS的表达;焦磷酸测序验证ADAR2对MAVS的3'UTR区域位点的编辑;双荧光素酶报告质粒检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR2和MAVS蛋白的表达。结果 ADAR家族中ADAR1丰度最高,其次ADAR2也有表达,而ADAR3的表达量很低,几乎检测不到(P<0.05);ADAR2对MAVS的3'UTR区域上的chr20:3869744位点发挥RNA编辑作用(P<0.001);MAVS的3'UTR编辑位点上,编辑型G比正常型A的荧光素酶活性显著降低(P<0.01);在转录和翻译水平,ADAR2都显著降低了MAVS的表达(P<0.05)。结论 ADAR2通过编辑MAVS的3'UTR上的chr20:3869744位点,使其发生A→G的替换,进而抑制了MAVS基因的表达。

Z-DNA结合蛋白与Zα结构域

Z-DNA结合蛋白包括人、哺乳类和病毒中的ADAR1、DLM-1、E3L蛋白以及在鱼类中最新报道的PKR-like(PKZ),其共同点是都含有Zα结构域。本文简述了这几种蛋白质的结构与功能,并着重分析Zα结构域与Z-DNA、Z-RNA、B-DNA等核酸分子的识别机制和亲和性。

社会隔离对BALB／c小鼠认知功能和海马5-HT2CR、ADAR1表达的影响

目的探讨社会隔离对BALB／c小鼠认知功能及5羟色胺2c受体（5-HT2Creceptor，5-HT2CR）和RNA腺苷脱氨酶1（adenosinedeaminasethatactOnRNA1，ADARl）表达的影响。方法选取健康BALB／c小鼠，按照随机原则（随机数字表法）分组，分别自生后21d起单笼饲养2周、4周和8周，建立社会隔离模型。对应的相同年龄正常群居饲养BALB／c小鼠作为相应对照组。采用新物体定位和新物体识别实验评估小鼠空间和非空间认知功能的改变，采用免疫蛋白印迹实验检测小鼠脑海马区5-HT2CR和ADARl表达的改变。结果新物体定位和新物体识别实验结果显示，与相应对照组相比，隔离2周组BALB／c小鼠的空间辨别指数明显降低[对照组为（0．075＋0．340），隔离组为（一0．653＋0．308），P〈O．05]，隔离2周和4周组BALB／c小鼠空间辨别指数无明显差异；隔离2周和4周组BALB／c小鼠非空间辨别指数明显降低[对照2周组为（0．088＋-0．210），隔离2周组为（-0．945＋-0．194），P〈0．05；对照4周组为（0．105＋0．267），隔离4周组为（-0．506＋-0．215），P〈0．05]，隔离8周组没有明显的改变；Westernblot结果显示，在海马区，与相应对照组相比，隔离2周BALB／c小鼠的5-HT2CR和ADARl蛋白表达明显减少[5-HT2CR：对照组为（1．025＋-0．144），隔离组为（0．891＋-0．026），P〈0．05][ADARl：对照组为（0．839--0．120），隔离组为（O．629＋-0．094），P〈0．05]。结论2周社会隔离可导致BALB／c小鼠的空间和非空间认知功能降低，同时引起BALB／c小鼠海马区5-HT2CR和ADARl蛋白表达的降低。

ADAR1诱导剂和抑制剂对社会隔离小鼠认知功能及ADAR1蛋白表达的影响

目的 探讨ADAR1诱导剂和抑制剂对社会隔离BALB/c小鼠认知功能和ADAR1表达的影响.方法 选取60只健康BALB/c小鼠按照区组随机化分为6组：群居对照组（GH）、社会隔离模型组（SI）、ADAR1诱导剂干预群居组（GH＋ IFN-γ）、ADAR1抑制剂干预群居组（GH＋EHNA）、ADAR1诱导剂干预隔离组（SI＋IFN-γ）和ADAR1抑制剂干预隔离组（SI＋EHNA）,每组10只小鼠.干预方式为腹腔注射,ADAR1诱导剂或抑制剂的给药剂量分别为5.0× 104 U/kg或10 mg/kg.采用物体识别实验检测小鼠认知功能改变.免疫组化和Western blot检测小鼠脑内ADARI的免疫反应活性和蛋白表达的改变.结果 在物体识别实验中,与GH组（0.41±0.17）相比,SI组（-0.16 ±0.09）小鼠的非空间辨别指数明显降低（P＜0.01）;SI＋IFN-y组（0.20±0.09）和SI＋EHNA组（-0.29 ±0.12）小鼠的非空间辨别指数分别高于（P＜0.01）和低于SI组（P＜0.05）.免疫组化实验结果显示,与GH组相比,SI组小鼠海马Hilus区[（0.021±0.002）,（0.013 ±0.003）,P＜0.01]和CA1区[（0.047 ±0.004）,（0.021±0.005）,P＜0.01]的ADARI免疫反应活性明显减弱;与SI组相比,SI＋ IFN-γ组小鼠海马Hilus区[（0.013 ±0.003）,（0.023±0.004）,P＜0.01]和CA1区[（0.021±0.005）,（0.040 ±0.005）,P＜0.01]的ADAR1免疫反应活性明显升高,ADAR1诱导剂干预隔离组逆转社会隔离引起的降低的ADAR1免疫反应活性.Western blot结果显示与GH组（1.00±0.00）相比,SI组小鼠海马区ADAR1的蛋白表达（0.48±0.07）明显降低（P＜0.01）;SI＋IFN-γ组小鼠海马区ADAR1的蛋白表达（0.82±0.04）与SI组相比,明显增加（P＜0.01）.结论 4周社会隔离应激刺激可导致BALB/c小鼠的非空间认知能力降低,海马区ADARI表达降低,ADARI诱导剂和抑制剂可分别逆转和加重社会隔离引起的认知功能障碍,相关机制与ADAR1表达有关.