脆性X智力障碍蛋白靶向DDX5调控Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞上皮-间质转化发生

目的探讨脆性X智力障碍蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)促进乳腺癌细胞迁移、上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)发生及其可能的作用机制。方法采用RT-PCR、Western blot方法,分析FMRP在正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和4种乳腺癌细胞系(MCF-7、BT474、MDA-MB-231、HCC1937)中mRNA和蛋白表达,免疫组化染色检测FMRP在乳腺癌组织中的表达;GEO数据库分析FMRP基因在乳腺癌中的表达及与临床预后的关系;采用慢病毒感染和siRNA干扰技术分别构建FMRP过表达及干扰载体,转染人乳腺癌细胞系MCF-7,设置对照组(Control)、干扰空载体组(NC)、敲低载体组(si FMRP)以及过表达空载体组(Lv-NC)、过表达载体组(Lv-FMRP);划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测各组细胞中EMT标志物[上皮标志物E-cadherin,间质标志物N-cadherin、vimentin、ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)、Slug(snail family zinc finger 2)]表达;免疫共沉淀联合质谱分析(IP-MS)验证FMRP与DEAD box RNA解旋酶-5(DEAD-box helicase5,DDX5)蛋白的互作关系,利用蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132检测FMRP对DDX5蛋白表达的调控作用;同时转染si DDX5载体,观察DDX5是否可以逆转FMRP过表达对细胞迁移、EMT的影响;采用免疫荧光染色检测β-catenin的定位及表达,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路核心标志物蛋白表达。结果FMRP在乳腺癌组织及细胞中呈高表达(P<0.05),FMRP高表达组总生存和无进展生存低于FMRP低表达组(P<0.05);敲低FMRP后MCF-7细胞迁移能力减弱,过表达FMRP促进细胞迁移(P<0.05);敲低FMRP后E-cadherin表达升高,N-cadherin、vimentin、ZEB1、Slug表达降低,抑制EMT发生,而过表达FMRP则促进EMT进程(P<0.05);FMRP与DDX5蛋白互作,且通过阻断泛素-蛋白酶体途径促进DDX5蛋白稳定性;敲低DDX5逆转FMRP过表达对细胞迁移及EMT的促进作用(P<0.05),且有效抑制β-catenin核转位,降低β-catenin核分布;进一步发现DDX5下调后p-β-catenin、GSK3β、Axin2蛋白表达升高,C-myc蛋白表达降低(P<0.05),而联合FMRP过表达逆转上述蛋白的表达(P<0.05)。结论FMRP靶向DDX5通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞迁移和EMT进程。

DDX5通过上皮-间质转化促进人乳腺癌细胞侵袭

目的探究DEAD box RNA解旋酶-5(DEAD-box helicase 5,DDX5)蛋白对乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移作用的影响及其机制。方法利用慢病毒感染法,构建过表达Flag-DDX5的人乳腺癌MCF-7稳转细胞系,划痕实验和Transwell实验检测DDX5蛋白过表达后对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响;Western blot实验检测上皮-间质转化(EMT)标志物上皮-钙黏蛋白(E-cadherin),纤维连接蛋白(Fibronectin),波形蛋白(Vimentin)的表达。结果成功构建了稳定过表达DDX5的乳腺癌MCF-7稳转细胞系;DDX5蛋白过表达后,乳腺癌细胞迁移和侵袭能力明显增强,乳腺癌细胞E-cadherin的表达明显下调,Fibronectin与Vimentin的表达明显上调。结论DDX5可能参与乳腺肿瘤细胞EMT过程,促进乳腺癌的恶性转移,进而影响乳腺癌的进程。