检测总RNA质量的两种方法比较研究

采用普通琼脂糖凝胶电泳和甲醛变性胶电泳两种方法对小鼠、藏绵羊的新鲜组织及非洲绿猴肾细胞提取的总RNA进行检测,比较两种方法对总RNA质量检测的特点.结果显示:甲醛变性胶对总RNA质量检测结果明显优于普通琼脂糖凝胶,证明对总RNA质量的检测更适合采用甲醛变性胶电泳法.

冷缺血时间与胆道闭锁肝组织RNA质量的相关性分析

目的分析冷缺血时间与胆道闭锁肝组织样本中RNA浓度、纯度及完整性(RIN)的相关性,为获得高质量肝组织样本提供标准。方法选取天津市第一中心医院30例因胆道闭锁行肝移植术患者的肝组织,室温放置0、0.25、0.5、1、2、3、5和12 h后分别加入RNAlater,4℃过夜,提取总RNA,检测RNA浓度、纯度及RIN值,根据浓度计算出产量,运用单因素方差分析分析冷缺血时间与胆道闭锁肝组织样本中RNA产量、纯度及RIN值的相关性,典型相关分析分析不同冷缺血时间后组织样本RNA产量、纯度及RIN值之间相关性。结果组织样本冷缺血0、0.25、0.5、1、2、3、5和12 h后,每10mg组织样本的RNA产量分别是(9.123±0.530)、(9.220±0.606)、(9.000±0.862)、(9.067±0.498)、(9.027±0.523)、(9.143±0.627)、(9.113±0.446)和(9.193±0.492)μg(P=0.78)。RNA纯度的比值分别为1.914±0.065、1.896±0.060、1.904±0.053、1.907±0.057、1.896±0.057、1.888±0.050、1.908±0.060和1.899±0.059(P=0.74)。RIN值分别为9.077±0.104、8.777±0.138、8.650±0.187、8.197±0.188、7.963±0.227、7.597±0.301、4.433±0.272和3.747±0.236(P=0.000)。单因素方差分析显示冷缺血时间与RNA的产量和纯度均无相关性,与RIN值显著相关。典型相关分析显示不同冷缺血时间后组织样本RNA产量与纯度、产量与RIN值及纯度与RIN值之间均无相关性。结论冷缺血时间与胆道闭锁肝组织RNA质量具有显著相关性,缩短冷缺血时间可获得高质量RNA。

拟南芥中的SmD1蛋白、RNA质量控制机制与转录后基因沉默机制

RNA质量控制(RQC)是细胞内降解功能障碍RNA的机制。SmD1蛋白属于核糖核蛋白颗粒(RNP),影响转录后基因沉默(PTGS)机制。SmD1不通过参与siRNA的生成,也不通过剪接作用影响PTGS。其影响效果的强弱与拟南芥品系自身沉默诱导的强度有关。RQC途径和PTGS途径竞争相似的RNA底物,RNA底物共享可能仅在RQC途径变得低效或受损时发生。内源基因难以产生siRNA并进入PTGS途径。相反,转入基因更易产生大量的异常RNA,从而引发PTGS。SmD1通过限制RQC机制降解转入基因产生的异常RNA,允许异常RNA进入细胞质siRNA体,以促进PTGS。

深低温冻存肾肿瘤患者全血细胞RNA提取质量的影响因素

为了研究深低温冻存的全血细胞RNA提取质量的影响因素,本文选择海军军医大学附属长海医院生物样本库收集、冻存的186份肾肿瘤患者的全血细胞标本,采用商用试剂盒提取RNA并测定其纯度。根据不同冻存时间和冻存位置比较各组全血细胞RNA提取质量。结果表明:本组全血细胞RNA的冻存时间中位数为101(62,127.25)d,260 nm和280 nm波长处的吸光度比值(A260/A280)中位数为1.87(1.76,1.92),A260/A230比值中位数为1.72(1.23,1.96),样本RNA提取质量合格率61.3%;冻存时间短的样本RNA提取质量合格率高于冻存时间长的样本,且随着冻存时间变长,A260/A280比值下降。冻存于深低温冰箱上层的样本RNA提取质量合格率高于下层的样本。冻存时间和冻存位置均会对深低温冻存的全血细胞RNA提取质量有影响,应在样本冻存时予以注意。

草石蚕块茎总RNA提取及质量分析

采用3种方法提取草石蚕块茎的总RNA,以期筛选出适合草石蚕块茎总RNA提取的最佳方法。结果表明,RNAiso Reagent法提取草石蚕块茎总RNA的28S和18S条带清晰明亮,RNA无降解,无DNA污染,质量较好。王艳红法和TRIzolR Reagent一步提取法提取总RNA的28S和18S条带较暗,提取的总RNA有降解现象。根据紫外分光光度计检测结果分析,3种方法提取草石蚕块茎总RNA的纯度都较好。从提取RNA的产量来看,RNAiso Reagent法提取总RNA的浓度最高,为1112μg/mL,王艳红法次之,TRIzolR Reagent一步提取法最低。因此,RNAiso Reagent法是草石蚕块茎总RNA提取的最佳方法。

高质量鸭肝脏组织总RNA的提取及稳定性测试

为获得高质量的鸭肝组织RNA样本,通过优化提取方案,从1 g超低温(-80℃)的冻存组织中提取RNA,以紫外分光光度计对RNA的含量进行了测定,并对其纯度进行了分析;通过琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行了检测,并对所得样本的稳定性进行了测试。结果表明:试验得到了1 528μg RNA,样品OD260/OD280=1.93,电泳得到的28 s和18 s RNA条带清晰可见,没有发生降解,样品在室温条件可保存24 h以上,在-20℃可保存8 d以上。提取的RNA质量较高。

快速制备RNA小分子质量标记的新方法

在锤头型核酶下游增加一段核酶作用的靶序列 ,使之成为自切割的核酶 .将自切割核酶基因合成 ,扩增并克隆在质粒pBluescriptSK上 ,经连续 4次克隆获得含 10个拷贝的自切割核酶基因的载体 .5%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳结果显示 :体外转录过程中多体酶发生了自切割 ,核酶转录物切割成从 70nt到 70 6nt的RNA等梯度带 ,因此 。

辣椒组织总RNA提取方法研究

从RNA的完整性、纯度和产量等方面比较了3种RNA提取试剂对辣椒不同组织部位RNA的提取效果。结果表明,RNAplant能从成熟组织中获得较高质量和产量的RNA,用该方法提取的辣椒老化组织RNA经RT-PCR能成功进行内参检测。

瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化

通过优化瘤胃液前处理方法,提高瘤胃微生物RNA提取数量与质量。试验优化4个前处理条件,共组合形成5个处理组。前处理完成后,利用Trizol进行RNA提取,检测RNA浓度和完整度(RIN)。结果显示,提取瘤胃内容物和瘤胃菌体RNA浓度和完整度的影响没有显著差异(P>0.05)。液氮保存的样品提取的RNA浓度和完整度均显著(P<0.05)高于RNA保护液保存的样品。解冻处理对RNA浓度的影响无显著差异(P>0.05),但是不解冻处理提取的RNA完整度显著高于解冻处理(P<0.05)。液氮冷冻研磨提取的RNA浓度(P<0.05)显著高于常温研磨,但是对RNA完整度的影响没有显著差异(P>0.05)。瘤胃内容物、液氮速冻、不解冻处理结合冷冻研磨方法所提取RNA的RIN值为9.43,完整度最高。瘤胃内容物、液氮速冻、解冻离心收集菌体结合冷冻研磨方法所提取的RNA浓度为1048 ng/μL,为最高浓度。因此,瘤胃内容物直接液氮速冻并在不解冻条件下冷冻研磨,所提取的RNA效果最好,可用于后续宏转录组学试验。

冰冻组织样本病理质控在转化研究中的应用价值

目的探讨冰冻保存组织样本病理质控在转化研究中的应用价值。方法选取93例生物样本库中长期保存的非小细胞肺癌患者的肿瘤、癌旁和远端正常肺组织,共848份通过冷冻切片染色进行病理诊断复核和肿瘤细胞含量评估;取其中172份样本进行RNA纯度和完整性检测,165份样本进行DNA浓度和质量检测。结果 93例非小细胞肺癌样本有6例与原病理诊断不符,总样本的病理诊断合格率为93.55%(87/93),癌组织为77.8%(245/315),癌旁组织为99.02%(202/204),正常组织为97.57%(321/329)。RNA纯度OD260/280为2.037±0.57RNA分子RIN为7.47±1.69,DNA最大浓度为200.69 ng/μl最小浓度为11.60 ng/μl,平均131.29 ng/μl。结论加强研究用样本使用前的病理诊断和肿瘤细胞含量质控是确保下游分子实验的重要保障。

3种RNA提取方法在血清丙型肝炎病毒RNA定量检测中的性能评价

目的比较3种方法对血清HCV RNA的提取性能,并对其作方法学评价,揭示RNA提取技术对HCVRNA定量的影响。方法使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Q法),NucliSens miniMag系统(M法)和匹基(PG)丙型肝炎病毒定量试剂盒自带RNA提取方法(P法)进行血清HCV RNA提取,实时荧光RT PCR定量检测,对77例临床血清标本进行了提取检测,同时设计了方法学评价实验,从准确度,重复性,线性和灵敏度方面评价3种方法。结果77例临床标本的M、Q和P法阳性率分别是85.7%、84.4%和36.3%;25例共同阳性标本中,M和Q法的CT值分别比P法平均低7.5和9.35,表现出高于P法的提取效率和RNA质量;M和Q法的标准变异指数(S.D.I.)绝对值均<2,P法S.D.I.绝对值>2;M法平均CV为40.0%,Q法为71.0%,P法>100.0%;M法表现最佳的线性(R>0.99),M、Q和P法的最低检测限分别为39.4、394和3943 IU/ml。结论从提取效率和收获RNA质量上M和Q法远远优于P法,进一步方法性能表明,M法为HCV RNA定量最佳提取方法,而P法因其提取效率低、收获RNA质量差以及重复性不好,不适合临床HCV RNA定量试验。

3种方法提取湖北钉螺RNA的比较

目的比较改良SDS法、TRIzol法和CTAB法对湖北钉螺RNA的提取效果,以期获得一种经济、高效,适于湖北钉螺大样本RNA的制备方法。方法采用改良SDS法、TRIzol法和CTAB法分别提取湖北钉螺RNA,利用核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度,通过浓度计算产率,纯度以A260/A280、A260/A230表示;以1%琼脂糖凝胶电泳进一步检验RNA完整性;以β-acting为目的基因进行RT-PCR,验证提取的RNA能否满足RT-PCR的实验要求。结果经方差分析,3种方法的产率差异具有统计学意义(F=16 895.85,P<0.01);经LSD检验,改良SDS法产率较高,其次为TRIzol法,CTAB法产率较低。CTAB法提取的RNA纯度较高,A260/A280、A260/A230分别在1.8~2.0和2.0~2.2之间,其余两种方法的A260/A230均低于2.0。改良SDS法提取的RNA完整性较好,电泳结果显示28S、18S和5S条带完整清晰,条带之间无明显弥散现象;而TRIzol法未见28S条带,CTAB法仅见18S条带。3种方法提取的RNA经RT-PCR均能扩增出阳性条带。相比另外两种方法,改良SDS法成本低、耗时少。结论改良SDS法是一种经济、高效,适于湖北钉螺大样本RNA的制备方法。

mRNA的出核转运

mRNA的出核转运是真核生物基因表达的重要步骤之一,它与pre-mRNA的各个加工过程都存在密切的偶联。这种偶联对于基因表达的高效准确完成至关重要。本文介绍了mRNA出核转运与pre-mRNA加工及质量监控之间的关联,并总结了近年来关于mRNA出核转运的研究进展。

核内mRNA的稳定性(英文)

真核生物的基因表达由多种不同层次上的生物学事件所调控,如转录因子调节基因转录的发生时间和转录强度,RNA加工转录速度,RNA加工过程和翻译过程中对mRNA稳定性的影响。mRNA分子,相对其它生物分子而言,易受核酸酶的攻击而更不稳定。RNA的数量和质量上的维系在多种生物过程中是一个关键的影响因素。大量研究表明RNA的稳定性是在细胞核和细胞质中进行精细调控的过程,在转录中和转录后的加工修饰以及翻译的过程中均会发生。新生RNA在细胞核内稳定性的研究是近年来的研究热点。在本文中,我们总结了细胞核内的mRNA稳定性的最新研究进展,表明细胞核内mRNA的稳定性以及其相应的RNA质量控制机理广泛存在,并且和RNA生成、修饰加工以及成熟的每个步骤均有关联。