利用T_4RNA连接酶在单链DNA/RNA的5'末端进行荧光、同位素以及生物素标记

利用Ｔ４ＲＮＡ连接酶在单链ＤＮＡ／ＲＮＡ的５′末端进行荧光、同位素以及生物素标记对于核酸研究来说ＤＮＡ／ＲＮＡ的末端标记是一项很重要的技术。酶法标记比有机化学法标记更简单方便。这是由于酶学反应具有温和、特异、可控制性和高效性的特点。酶法的３′端标记技...

过表达环状RNA泛素连接酶E3(circHERC4/hsa_circ_0007113)抑制细胞衰老的研究

目的研究泛素连接酶E3的环状RNA(circHERC4/hsa_circ_0007113)与人胚肺成纤维细胞(IMR-90)的衰老的关系。方法从circBase数据库上获得环状RNA circHERC4的全基因序列,将其克隆到环状RNA表达载体pLC5-ciR中,体外构建重组体pLC5-ciR(+)hsa_circ_0007113,经PCR、酶切、测序等对重组质粒进行鉴定。利用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染到HEK293T和IMR90细胞中,并利用RT-PCR检测正常细胞组、空载体组及重组载体组中环状RNA circHERC4的表达情况;SA-β-gal染色检测各组细胞衰老情况;CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果测序正确,成功构建了环状RNA circHERC4的过表达载体,circHERC4可在HEK293T细胞中高效表达。与对照组相比,重组载体组的SA-β-gal染色阳性率降低(P<0.05),细胞增殖率升高(P<0.05)。过表达circHERC4后能提高IMR90细胞的增殖,抑制细胞的衰老。结论circHERC4具有潜在的抗衰老作用,为深入研究circHERC4的功能奠定了基础。

急性脑梗死病人血清circ_HECTD1表达与病情严重程度的关系

目的:探讨急性脑梗死(ACI)病人血清环状RNA HECT结构域E3泛素蛋白连接酶1(circ_HECTD1)表达情况,分析circ_HECTD1与病情严重程度的关系。方法:选取2020年9月—2021年11月开滦总医院收治的ACI病人122例为ACI组,另选同期于本院体检的健康志愿者122名为对照组。收集基本临床资料,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测血清circ_HECTD1水平。Pearson法分析ACI病人血清circ_HECTD1水平与临床资料及美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的相关性;多因素Logistic回归分析ACI严重程度的影响因素。结果:ACI组高血压比例、空腹血糖、白介素(IL)-6、IL-1β、C反应蛋白(CRP)、白细胞计数(WBC)及circ_HECTD1水平均高于对照组(P<0.05);中度组、重度组年龄、IL-6、IL-1β、空腹血糖、CRP、WBC及circ_HECTD1水平均高于轻度组(P<0.05);多因素Logistic回归分析显示,糖尿病、IL-6、IL-1β及circ_HECTD1均是ACI病人中重度神经缺损的危险因素(P<0.05);血清circ_HECTD1水平与空腹血糖、WBC、IL-6、IL-1β、CRP及NIHSS评分均呈正相关(P<0.05)。结论:ACI病人血清circ_HECTD1水平升高,且随病情加重而增加,是中重度神经缺损的危险因素。

单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析

本文利用T4 RNA连接酶将5’-磷酸、3’-氨基修饰的引物1连接到马尾松毛虫质型多角体病毒第8片段dsRNA的3’-OH端。经逆转录、退火、补齐形成全长双链cDNA。使用单一的互补引物2进行PCR扩增。扩增产物克隆在pMDl8-T载体上。对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定,结果表明,克隆片段全长330bp,S’端具有CPV-1型末端保守序列AGTAAA’端具有保守序列GTTAGCC。起始密码子从ATG位于38-40残基,终止密码子TAA位于1208～1210残基。推测S8片段编码390个氨基酸多肽。分子量为44kDa。与舞毒蛾质型多角体病(LdCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97％和98％。与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83％和85％。与人的呼肠孤病毒第8片段比较没有明显的同源性。

Circ_HECTD1调节miR-135a-5p/TP53INP1轴对OGD/R诱导的海马神经元损伤的影响

目的通过进行体外氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导海马神经元损伤,观察环状RNA含HECT结构域的E3泛素连接酶1(Circ_HECTD1)对HT22细胞增殖、凋亡的影响以及对微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)/肿瘤蛋白53诱导型核蛋白1(TP53INP1)轴的调控机制。方法常规培养HT22细胞,将细胞分为Con组、OGD/R组、si-NC组、si-Circ_HECTD1组、miR-NC组、miR-135a-5p组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p组。qRT-PCR法检测Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表达;MTT检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验验证Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1的靶向关系;Western blot法检测Bax、Bcl-2、TP53INP1蛋白表达。结果OGD/R诱导后HT22细胞中Circ_HECTD1与TP53INP1表达上调,miR-135a-5p表达下调,细胞存活率和Bcl-2蛋白表达显著下降,凋亡率和Bax蛋白表达显著升高(均P<0.05)。沉默Circ_HECTD1表达能够显著上调OGD/R诱导的HT22细胞中miR-135a-5p表达,下调TP53INP1表达,提高细胞存活率和Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率和Bax蛋白表达(均P<0.05)。Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1之间均存在靶向关系。过表达miR-135a-5p能够显著下调TP53INP1表达,提高细胞存活率、Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率、Bax蛋白表达(均P<0.05)。而抑制miR-135a-5p表达能够部分逆转沉默Circ_HECTD1对HT22细胞损伤的保护作用。结论沉默Circ_HECTD1可通过调节miR-135a-5p/TP53INP1轴,促进细胞存活,抑制细胞凋亡,保护OGD/R诱导的海马神经元损伤。

circ-ITCH抑制结直肠癌细胞增殖和转移的作用机制研究

目的研究环状RNA Itchy E3泛素蛋白连接酶(Circ-ITCH)在结直肠癌(CRC)细胞增殖和转移中的作用及通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥作用的机制。方法采用实用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CRC和癌旁组织中Circ-ITCH的表达水平,分析Circ-ITCH的表达水平与患者病理参数和预后的关系。qRT-PCR检测细胞SW480、SW620和HT29及正常结肠细胞NCM460中Circ-ITCH的表达水平,筛选Circ-ITCH低表达水平的CRC细胞,分为对照组(NC组)和Circ-ITCH组,构建空载质粒和Circ-ITCH过表达水平转染质粒,分别转染各组细胞。qRT-PCR检测各组细胞中Circ-ITCH的表达水平;细胞计数试剂8(CCK8)实验检测各组细胞增殖能力;Transwell实验检测各组细胞转移能力;TOP/FOP双荧光素酶实验检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路的活性;Western blot检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin及其下游增殖相关蛋白cyclinD1、cMyc和转移相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9的表达水平。结果Circ-ITCH在CRC组织中表达水平低于在癌旁组织中的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。Circ-ITCH低表达与患者淋巴结转移和TNM分期相关(P<0.05),Circ-ITCH低表达水平的患者预后较差(P<0.05)。Circ-ITCH在CRC细胞SW480、SW620和HT29中的表达均低于在正常结肠细胞NCM460中的表达,其中在SW620细胞中的表达水平最低。与NC组相比,Circ-ITCH组SW620细胞中Circ-ITCH表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),Circ-ITCH组SW620细胞增殖和转移能力降低,差异有统计学意义(P<0.05);Circ-ITCH组SW620细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);Circ-ITCH组SW620细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin核表达及其下游增殖相关蛋白cyclinD1、cMyc和转移相关蛋白MMP2,MMP9的表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Circ-ITCH通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制CRC增殖及转移能力,具有作为抗CRC治疗分子靶点的潜力。

RtcB功能的研究进展

RtcB是后生动物中一种重要的RNA连接酶,能完成2′,3′-环磷酸酯和5′-羟基末端的连接。在tRNA的成熟和XBP1 mRNA的剪接中起着重要的作用。它可以连接tRNA成熟过程中产生的2′,3′-环磷酸末端和5′-羟基末端,从而产生成熟的tRNA。另外,可以连接XBP1前体mRNA产生成熟的XBP1 mRNA,调节UPR反应,从而维持内质网稳态。另外,RtcB对动物胚胎发育和抗体分泌具有重要调节作用,并且与多种神经性疾病的发生密切相关。本文将对RtcB的发现、连接酶功能以及生理功能进行综述,为以后更好地研究其功能及相关机制打下基础。