mRNA差异显示方法的建立及条件优化

目的研究大鼠皮肤肌肉特异性基因的表达,探讨引物的不同、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系。方法12只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为正常对照组与实验组(挫伤4h)。分别提取总RNA,反转录成cDNA,通过不同引物、退火温度及反应体系进行PCR产物扩增,比较不同条件下差异条带的情况。结果总RNA量在2-4μg时,扩增条带最亮;提高反转录温度有利于长片段cDNA的合成;使用TaKaRa公司带有T7启动子的OligodT12NM和M13的随机引物时,可最大限度地减少非特异性条带;先使用低严谨的退火温度,再使用高严谨的退火温度可显著地增强差异条带重复性和敏感性。结论差异显示技术方法简便、灵敏、高效,适用于一般性的基因差异表达研究。

mRNA差异显示条件的优化

运用优化的mRNA差异显示技术分离受内生真菌诱导的差异基因。优化差异显示条件表现在增加锚定引物和随机引物的长度、改变PCR参数和再扩增程序、运用银染显色等。应用这些条件共获得7个阳性差异片段。用未优化的PCR程序1筛选35条差异带,得到3个两端均为随机引物的差示片段。而用优化的PCR程序2,52条差异带中得到9条只能用锚定引物和随机引物才能扩增出的片段。地高辛标记的反向-Northern鉴定为阳性后进行克隆和测序。PCR方法1所得的3个差示片段均无开放的阅读框。PCR程序2得到7个差异表达的基因中,2个为已知基因,5个为未知基因。因此可运用优化的差显技术分离差异表达的基因。

mRNA差异显示技术的研究进展

针对mRNA差异显示技术中的假阳性高和放射性污染等缺陷,文章从改进引物设计、应用非放射性标记、优化PCR参数、假阳性鉴定等方面进行了综述。1采用4种兼并或单碱基引物作锚定引物;用特异和长序列(≥20bp)专一性引物作为随机引物,可增加特异性;在锚定引物之前加上了一段T7启动子序列,在随机引物前加上一段M13重复序列,可使DDRT—PCR的体系的扩增特异性更一致。2针对放射性同位素检测法的缺点,文章提出并比较了几种常用的非放射性同位素标记方法。3保证起始(模板)mRNA质量和浓度,降低dNTP浓度,选择最适的反转录和PCR退火温度,可优化PCR参数。4用两种不同的反转录酶进行反转录平行实验,很容易区分出RNA制备过程中造成的假阳性,目前假阳性鉴定大多还是以Northern印迹为基础,再作些适当的改进。

mRNA差异显示技术在妇产科领域的应用

mRNA差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法,其通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的mRNA进行分组逆转录及PCR扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异,对各种不同类型、不同分化时期以及异常细胞差异表达基因进行分离和比较,具有简单、快速、灵敏、重复性好的持点。简介此项技术并综述其在女性生殖器肿瘤、妊娠滋养细胞分化及疾病和生殖调控中的应用。

应用差异显示技术克隆胶质瘤细胞诱导分化相关基因

目的 克隆胶质瘤细胞诱导分化相关新基因。方法 应用RNA随机引物差异显示、SSCP纯化、PCR产物快速克隆、反Northern杂交及生物信息学分析等方法 ,观察人脑胶质瘤细胞株SHG 44 9分化过程中的基因表达变化。结果 克隆了诱导分化前后表达差异显著的 1 5个基因 ,其中诱导后下调基因 4个 ,上调基因 1 1个。同源性分析表明 ,5个是已知基因 ,1 0个是未知基因。诱导后上调的DIG 1基因与c myc内含子结合蛋白 1 (MIBP1 )基因高度同源 ,此基因具有转录因子活性 ,表达的蛋白可抑制c myc基因的表达。结论 克隆了 1 5个人脑胶质瘤细胞诱导分化相关基因 ,其中控制c myc基因表达的MIBP1基因诱导分化后上调提示 ,它可能是调控胶质瘤细胞分化基因 ,值得进一步研究。