基于RNA-Seq技术探讨生(麸炒)白术对大鼠基因表达的差异性分析

目的:考察麸炒白术及生白术对实验大鼠肝脏转录组学的影响,从机体转录组角度筛选差异基因,探求白术炮制后对大鼠生物学效应的表达差异。方法:SD大鼠随机分为空白组、生白术组和麸炒组,每组3只。生白术组按照7.0 g/kg灌胃生品白术提取液,麸炒组按照6.0 g/kg灌胃麸炒白术提取液,空白组给予同体积生理盐水,连续给药21 d。给药结束后取大鼠肝脏,采用RNA-Seq全基因转录组法分析差异基因的表达。结果:生白术可上调Cyp7b1、Btg2 Pc3、Enpp2、Hao2等功能基因的表达,下调Ppplr3c、Car12功能基因的表达;麸炒白术可上调Cyp7b1、Enpp2、Hao2、Cy3a18、Cyp2c11等9个功能基因的表达,下调Aacs Hmgcs 1、Hmgcs1 Aacs、Alpl、Per3等7个功能基因的表达,生白术与麸炒白术均能上调Cyp7b1、Enpp2、Hao2等3个功能基因的表达,体现在促进类固醇激素合成、醚脂代谢、维持脂质平衡、增加机体代谢水平等生物功能。麸炒白术组与生白术组差异基因筛选结果表明,白术经过麸炒后对大鼠肝脏组织的基因表达同样存在特征性差异表达,麸炒白术组与生白术组相比,上调Car12、Arntl、Cldn1等3个功能基因,下调Rpl8、LOC等2个功能基因,麸炒白术可促进氮代谢、促进昼夜节律、增加机体免疫监视、提高免疫应答、对抗炎症等生物学功能。结论:研究表明生白术及麸炒白术均对大鼠肝脏组织的基因表达产生较为明显的影响,主要体现在对调控脂肪代谢、蛋白质代谢、类固醇合成、不饱和脂肪酸合成、糖原合成等多个功能基因的调控作用。

综合scRNA-Seq和Bulk RNA-Seq技术建立与肝癌CD8^(+)T细胞相关的预后模型

目的 通过单细胞测序(scRNA-Seq)和Bulk转录组测序(Bulk RNA-Seq)技术鉴定出与肝癌CD8^(+)T细胞相关的生物标志物并建立预后模型。方法 从GEO数据库中下载肝癌的单细胞数据集,通过scRNA-Seq技术提取患者与对照组间CD8^(+)T细胞的差异表达基因。从TCGA数据库中下载肝癌的基因表达谱数据及临床数据,使用CIBERSORT算法、WGCNA技术筛选出与CD8^(+)T细胞具有相关性的模块基因。将差异基因与模块基因取交集基因并进行GO、KEGG分析,应用单因素COX回归分析和LASSO算法建立预后模型。通过K-M曲线和ROC曲线对模型在内、外部数据集中的预测效果进行验证。根据风险评分的中位值划分高低风险组,对高低风险组间的浸润性免疫细胞分布情况和肿瘤突变情况进行分析。结果 构建出具有9个基因的预后模型,K-M曲线及ROC曲线表明模型在内、外部数据集中均具有良好的预测能力,在高低风险组中,浸润性免疫细胞的分布情况和基因突变情况均存在显著差异。结论 本研究结合scRNA-Seq和Bulk RNA-Seq技术利用生物信息学方法开发出了一种基于CD8^(+)T细胞的新型预后模型,为肝癌患者的预后改善和生存预测提供了可靠的理论依据。

基于BSA-seq和RNA-seq挖掘西瓜果皮硬度候选基因

为了挖掘西瓜果皮硬度关键调控基因,选育耐裂高硬度果皮西瓜品种。以西瓜果皮硬度差异显著的高硬度材料901和低硬度材料BSH为亲本,构建F 2分离群体,采用极端性状混池重测序接合BSA(BSA-seq)方法进行定位,并结合转录组测序(RNA-seq)数据进行关联分析,挖掘果皮硬度关键调控基因。BSA-seq结果表明,SNPs和InDels关联区域交集位于10号染色体1620000—3760000 bp区间内共2.14 Mb的区段,包含150个候选基因,其中2个非同义突变基因和1个移码突变基因。将BSA-seq测序结果与RNA-seq测序结果进行联合分析发现,共有Cla97C10G187120、Cla97C10G187020、Cla97C10G187430、Cla97C10G187510、Cla97C10G187280和Cla97C10G1865406个基因相关联,经生物信息学分析,确定Cla97C10G187120基因为西瓜果皮硬度候选基因。实时荧光定量(qRT-PCR)试验结果表明,转录组试验数据可靠,并且候选基因Cla97C10G187120在901中表达较BSH明显降低。本研究为进一步精细定位西瓜果皮硬度调控基因奠定了基础。

基于RNA-Seq技术的山羊嘴唇黏膜色素沉积相关差异表达基因筛选及初步分析

【目的】通过RNA-Seq技术筛选不同颜色山羊嘴唇色素代谢相关的候选基因,初步揭示山羊嘴唇黏膜颜色差异形成的分子机理,为动物黏膜色素代谢研究提供理论依据。【方法】以嘴唇等面部可视黏膜颜色存在差异的酉州乌羊(乌黑色)和板角山羊(粉色)为研究对象,采用Illumina Hiseq 2000测序平台对嘴唇黏膜组织进行转录组测序,所得序列经质控、组装后,以|log_(2)(Fold Change)|>1且q value<0.05为标准筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行功能注释和富集分析。【结果】利用RNA-Seq技术共筛选出249个基因差异表达,其中与粉色嘴唇黏膜组织相比,乌黑色嘴唇黏膜组织中上调基因有218个,下调基因有31个。23个差异表达基因被划分在9种TFs家族中,其中14个基因属于含有锌指结构域的转录因子家族。GO功能富集分析结果显示,差异表达基因主要参与离子转运相关生物学过程和分子功能。KEGG代谢通路富集结果显示,差异表达基因显著富集于催产素、钙、cGMP-PKG信号通路,以及肥厚性心肌病、心脏肌肉收缩等7个与肌肉组织功能相关的信号通路,其中钙和cGMP-PKG信号通路与色素代谢密切相关;此外,ASIP等12个基因富集到MAPK信号通路、cAMP信号通路、黑色素合成信号通路(Melanogenesis)等色素代谢核心通路中;CALML6、OXTR、ATP1A2、ATP1B44个差异表达基因同时富集到多条与色素代谢相关的通路。qRT-PCR结果与测序结果一致,表明测序结果可靠。【结论】初步确定ASIP基因为山羊嘴唇色素代谢的候选基因,CALML6、OXTR、ATP1A2、ATP1B44个基因参与了山羊嘴唇黏膜色素沉积过程,为研究山羊黏膜色素代谢的分子机制提供理论基础,也为探究人类黏膜异常着色的分子机制提供参考。

基于RNA-Seq技术筛选姜曲海猪子宫和卵巢发育相关基因

母猪的子宫和卵巢组织发育情况直接影响母猪的繁殖性能,进而对养猪业的经济效益造成重大影响。为探究姜曲海猪子宫和卵巢发育的分子机理,本研究选取1月龄和8月龄姜曲海猪各3头,利用转录组测序技术(RNA-Seq)对子宫和卵巢组织进行测序,通过生物信息学手段筛选差异表达基因并进行基因本体(Gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto ncyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,再与猪数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL)数据库比对后鉴定出重要的候选基因。结果显示,1月龄和8月龄姜曲海猪子宫组织中有1688个差异表达基因,表达上调和下调的基因各844个;卵巢组织中存在3833个差异表达基因,其中2831个表达上调,1002个表达下调。富集分析结果显示这些差异表达基因主要显著富集于动物器官发育、组织发育和细胞分化等生物学过程。本研究在子宫和卵巢组织中分别筛选出11个和31个与发育性状有关的候选基因,其中共有的候选基因有6个,分别为LHFPL1、MTUS2、LIF、RBP4、EPHB2和TESC。本研究结果为姜曲海猪子宫和卵巢发育分子层面的研究提供了参考,也为今后姜曲海猪繁殖性状的分子改良提供了新的研究方向。

基于RNA-seq不明原因复发性流产绒毛组织mRNA基因差异性表达研究

目的:构建不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)孕妇绒毛组织的mRNA差异性表达谱并进行功能分析,为阐明URSA的发生发展机制提供依据。方法:收集2022年3月于新疆医科大学第一附属医院妇科门诊收治的4例URSA(试验组)和4例选择性终止妊娠孕妇(对照组)的绒毛组织样本。应用转录组测序技术(RNA-seq)筛选2组差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并对其进行GO功能注释、KEGG通路分析及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析,进一步研究差异表达mRNA的功能,并筛选出URSA的关键基因。结果:RNA-seq分析共筛选出3350个DEGs,其中上调基因2259个,下调基因1091个。通过PPI网络分析,筛选出与URSA有关的前10个关键基因:TYROBP、CD74、GH1、GH2、STAT5A、HLA-DRA、STAT5B、HLA-DRB1、CISH和HLA-A。通过GO和KEGG生物学功能分析,发现差异性表达的mRNA参与到多种白细胞分化相关免疫反应通路和同种异体免疫应答等生物学过程。结论:利用RNA-seq获得的URSA的mRNA差异性表达谱,筛选出可能与URSA有关的关键基因及生物学通路,为进一步研究URSA的发病机制和诊疗靶点提供了理论依据。

基于RNA-Seq技术对不同品种猪排卵前卵泡差异表达基因的筛选与注释

[目的]筛选淮猪和大约克猪排卵前卵泡组织差异表达基因。[方法]采集淮猪和大约克猪各3头的排卵前卵泡,提取RNA,个体独立建库。采用RNA测序技术以及GO和pathway方法对所获序列进行显著性富集分析。[结果]测序后,获得的淮猪clean reads数分别为85958912、91701082、84448828,其中有效Reads数分别达到98.39%、98.59%、96.04%;获得的大约克猪clean reads数分别为87914166、80480542、85994612,其中有效reads数分别达到98.61%、96.95%、98.80%,测序饱和度良好(证明测序数据真实可靠)。结果表明,筛选到上调基因67个,下调基因54个。GO和Pathway分析发现,差异表达基因富集在繁殖过程、生长过程和代谢过程及WNT信号通路、卵巢类固醇生成通路和类固醇生物合成通路等。[结论]获得了猪排卵前卵泡基因表达谱,并筛选到与繁殖性状相关的关键候选基因。

基于RNA-seq对复合益生菌作用于肉鸡回肠中新转录本预测及可变剪接、SNP分析

为分析复合益生菌饲喂肉鸡回肠转录组中的新转录本预测、可变剪接事件和SNP,选择200只1日龄黄麻肉鸡随机分为2组,每组5个重复,每个重复20只。对照组正常饮水,益生菌组饮用水中补充1%复合菌制剂,试验分为生长前期(1~21 d)、后期(22~42 d)两个阶段。42日龄时进行肉鸡屠宰试验,取对照组和益生菌组回肠各3个样本进行转录组测序。对测序数据进行分析,共发现1047个新基因,20176个新转录本,276个新基因在GO数据库中得到归类注释。对转录组数据进行可变剪接分析,外显子跳跃(SE)占可变剪接类型的比例最高,共筛选到1131个显著的差异剪接基因,在外显子跳跃(SE)、第一个外显子可变剪接(A5SS)、最后一个外显子可变剪接(A3SS)、外显子选择性跳跃(MXE)、内含子滞留(RI)事件中鉴定到的差异剪接基因数分别为588、139、176、136、92。对获得的差异剪接基因进行GO富集分析,主要富集在代谢和免疫GO term。KEGG富集到了胞吞作用、MAPK信号通路等。在各样品中大多数碱基取代均为转换大于颠换,其中转换单核苷酸多态性(SNP)所占百分比为73.53%~73.94%;颠换型SNP所占百分比为26.05%~26.47%。试验对对照组、益生菌组肉鸡的回肠进行了RNA-seq测序分析,为发掘复合益生菌作用于肉鸡回肠中的可变剪接事件提供基础,为进一步了解复合益生菌作用于肉鸡回肠中新转录本的发现和SNP位点提供了数据支撑。

BSA-Seq结合RNA-Seq技术挖掘大豆叶片提前黄化衰老基因

大豆产量与其生殖生长的持续时间呈正相关,延缓其开花后叶片的衰老,提高其生理功能,有利于增加植物的粒重。叶片黄化是植物衰老的显著特征之一。关于在大豆鼓粒后期叶片黄化的研究鲜见报道。本研究对鼓粒后期叶片提前黄化突变体ly和野生型ofc杂交组合进行遗传分析,结果表明,大豆鼓粒后期叶片提前黄化性状受单隐性核基因控制。通过BSA-Seq在19号染色体得到一个2.23Mb的初定位区间,经开发标记图位克隆后将区间缩短至1.75 Mb,区间内有219个基因,再结合RNA-Seq分析,得到了区间内12个候选基因,其中有4个SNP变异基因和8个差异表达基因。本研究结果为大豆鼓粒后期叶片黄化衰老基因的克隆奠定了基础。

基于山羊肌内前体脂肪细胞RNA-seq数据的新基因发掘与分析

为挖掘山羊(Capra hircus)肌内前体脂肪细胞分化前后的新基因并对其进行GO功能和KEGG通路富集分析.利用转录组测序(Transcriptome sequencing,RNA-seq)技术对山羊肌内前体脂肪细胞分化前后的两组细胞cDNA样品(n=3)进行高通量测序,有效数据与山羊参考基因组比对后利用StringTie软件组装新基因.基于|log2foldchange|>0和P-adj<0.05筛选获得差异表达新基因,并利用clusterProfiler R包针对GO和KEGG数据库对新基因进行GO功能及KEGG通路注释.结果表明,组装获得的201个新基因可定位在山羊29对常染色体上,且在染色体2、3、5、11、18和29上定位富集.山羊肌内脂肪细胞分化前后表达上调的新基因共28个,表达下调的新基因共57个.在GO功能富集方面,共21个新基因注释到277个GO功能亚类中,其中GO功能条目中参与生物过程、细胞组成和分子功能的基因分别占73.65%、3.97%和22.38%,且3个条目中显著富集的GO功能亚类分别与代谢功能、病毒组装和分子结合相关.此外,共21个新基因富集到16条KEGG通路中,其中氨基酸生物合成通路富集的新基因最多,为3个.研究结果挖掘了山羊肌内脂肪细胞分化前后的新基因201个,为揭示山羊肌内前体脂肪细胞分化相关的新基因并进一步完善山羊功能基因组提供基础数据.

基于RNA-seq的生孢噬纤维菌新转录本预测及生物信息学分析

利用RNA-seq技术,对不同碳源条件下培养的生孢噬纤维菌CX11进行新转录本预测,实时荧光定量PCR结果表明测序数据可信度较高。共发掘新转录本1298个,其中371个新转录本在不同碳源比较组合中差异表达(p<0.05),差异转录本数目与碳源的复杂度成正相关。共有19个新转录本在滤纸和葡萄糖比较组合中的差异倍数超过8倍,且在其他比较组合中差异倍数明显降低,推测这些新转录本与滤纸的前期降解密切相关。GO功能分析显示437个新转录本获得注释,有机物代谢过程、碳水化合物衍生物结合、氧化还原酶活性、水解酶活性等功能显著富集,原位酶活测定结果表明水解酶活性富集合理可信。KEGG通路分析表明,共有296个新转录本富集到氨基酸生物合成、次级代谢产物生物合成、碳代谢、氧化磷酸化、ABC转运蛋白、群体感应等30条代谢通路中。

基于RNA-Seq探究蔗糖影响黑果枸杞枝刺发生的机理

【目的】黑果枸杞Lycium ruthenicum是集生态、经济和药用价值等为一体的灌木。然而,其密集的枝刺严重阻碍其作为经济林推广,本研究旨在探究蔗糖(Suc)促进黑果枸杞(黑杞)枝刺的发生机理,为培育其无刺优良品种提供依据。【方法】在证明Suc通过能量和信号路径促进黑杞枝刺发生的基础上,利用RNA-Seq对无刺茎顶芽(TleCK)、有刺茎顶芽(ThoCK)、黑暗处理的有刺茎顶芽(ThoDCK)、减少内源Suc处理后有刺变无刺茎顶芽(TleDPL)和喷施外源Suc后无刺变有刺茎顶芽(ThoSuc)5种样品的差异表达基因(DEG)和叶绿体差异基因(cpDEG)进行筛选和分析,并采用RT-qPCR验证了9个DEG的表达情况。【结果】5组有刺和无刺材料顶芽之间(ThoCK vs.TleCK、ThoCK vs.TleDPL、ThoDCK vs.TleDPL、TleCK vs.ThoSuc和TleDPL vs.ThoSuc)的DEG分别为5281、4363、3125、5226和3278个,这5组DEG共同显著富集在9个GO条目和4个KEGG通路(“类黄酮生物合成”“二萜生物合成”“苯丙烷生物合成”、“芪类、二芳基庚烷和姜辣素生物合成”)。韦恩图显示5组比较组共有的DEG是196个,其中33个被预测为转录因子基因,较多转录因子基因被预测为NAC和WRKY家族。5组比较组有3个共有DEG注释在植物激素信号转导KEGG通路,分别参与生长素、茉莉酸和水杨酸信号传导。3个关键有刺和无刺比较组(ThoCK vs.TleCK、ThoCK vs.TleDPL和TleCK vs.ThoSuc)中共有2个DEG被预测为TCP转录因子基因,这3个比较组均有cpDEG被注释到光合作用KEGG通路。9个DEG的RT-qPCR验证了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】Suc可能通过影响生长素、茉莉酸和水杨酸信号传导以及赤霉素合成基因表达来促进黑杞枝刺发生,枝刺发生也可能与类黄酮积累和木质素减少有关,而且增施外源和减少内源Suc并非通过简单地逆转cpDEG的表达来影响枝刺发生。注释到WRKY、TCP和NAC转录因子家族的共有DEG可能是调控枝刺发生的关键基因。本研究建立了Suc影响黑杞枝刺发生的机理模型图。

通过RNA-seq探究外源性硫化氢对肝癌细胞系HepG2的影响

目的探究外源性硫化氢(hydrogen sulfide,H 2S)对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的影响及可能的分子机制,为HCC诊疗提供理论实验支持。方法从GEO数据库中获取HCC的基因表达数据,并筛选外源性H 2S处理HepG2细胞的RNA-seq数据,通过差异基因筛选、GO和KEGG通路分析,确定H 2S调控的主要生物学功能和信号通路。结果数据分析表明,与正常组织相比,肝癌组织中硫化氢合成关键酶胱硫醚γ裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)和胱硫醚合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)的表达显著下降。筛选出3640个差异基因,其中317个与细胞衰老、580个与细胞增殖、43个与凋亡相关。通过蛋白互作网络分析,Jun、MAPK1和MAPK3等关键基因被识别,提示H 2S可能通过调控Jun/MAPK信号通路影响HCC的发生发展。结论H 2S在HCC中可能通过Jun/MAPK通路发挥的调控作用,为H 2S在HCC中的分子机制研究和潜在治疗应用提供了基础。

RNA-seq技术在虾蟹研究中的应用

基于高通量测序技术的RNA-seq技术已被广泛应用于较高经济价值的虾蟹类动物研究中,从分子水平剖析虾蟹类生命周期中相关基因的调控功能和遗传信息。本文综述了对虾蟹类动物转录组研究现状,包括虾蟹类的生长发育、生殖繁育、环境胁迫、免疫应答、营养代谢和分子标记开发等,分析了RNA-seq技术在虾蟹类研究中面临的局限与挑战,以期为更深入开展虾蟹类分子生物学研究提供参考。

基于RNA-Seq技术的牦牛体外受精胚胎发育转录组分析

【目的】探明不同发育阶段牦牛体外受精(IVF)胚胎的转录组差异,了解差异表达基因(DEG)在功能、分类和代谢通路的差异,为揭示牦牛早期胚胎发育调控机制,促进牦牛胚胎体外生产技术的发展提供理论基础。【方法】以IVF技术生产的牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的胚胎为样本分别提取总RNA,采用Smart-Seq2扩增技术构建5个测序文库,应用Hi SeqTM 2500高通量测序技术进行转录组测序,对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。【结果】牦牛IVF后的卵裂率和囊胚率分别为69.3%和26.2%。2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的牦牛胚胎Clean reads为47 355 570—50 855 888条,其中有85.65%—90.02%的reads能比对到牦牛参考基因组序列上;8-细胞的胚胎比对上的转录本最多(14 893),而囊胚比对上的转录本最少(9 827)。牦牛胚胎转录本主要有5种可变剪接类型,转录起始区域可变剪接(TSS)和转录结束区域可变剪接(TTS)所占比例最大;牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚基因组分别有116601、234 131、196 420、70 841和94 840个位点存在单核苷酸多态性(SNP)。在4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚期开始表达的基因分别有1 221、1 116、142和564个;随着胚胎发育的进行,BMP15、KIT、GDF9、STAT3、ZP3和ZP4等母源基因的表达量逐渐减少,而SARS、IL18、ACO2、TXN2、ATP5B、PCGF4、UBE3A、MAPK13、SNURF和JUP等胚胎基因的表达量则逐渐增加。以|log2ratio|≥1且Q-value<0.05为筛选标准,在2-细胞和4-细胞胚胎、4-细胞和8-细胞胚胎、8-细胞胚胎和桑椹胚以及桑椹胚和囊胚比对中分别筛选到6 922、7 601、8 071和10 555个DEGs。GO分析表明,4个发育阶段的DEGs归类注释都涉及生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)3大类62个二级条目。通过KEGG pathway数据库分析,2-细胞和4-细胞期胚胎的DEGs参与到308条通路中,显著富集剪接体、RNA转运和泛素介导的蛋白水解等11条通路;4-细胞和8-细胞胚胎的DEGs参与到310条通路,显著富集嗅觉转导、神经活性配体-受体互作和核苷酸切除修复等9条通路;8-细胞期胚胎和桑椹胚的DEGs参与到316条通路,显著富集嗅觉转导、泛素介导的蛋白水解和神经活性配体-受体互作等10条通路;桑椹胚和囊胚的DEGs参与到315条通路,显著富集剪接体和RNA转运2条通路。【结论】利用高通量测序技术对牦牛IVF胚胎不同发育阶段的转录组进行测序和分析,揭示了牦牛胚胎发育不同阶段差异表达基因的数量,获得了差异表达基因的功能、分类和代谢通路。为丰富牦牛胚胎转录组信息,揭示牦牛胚胎发育分子调控机制及完善其胚胎体外培养技术研究奠定基础。

转录组与RNA-Seq技术

转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合。通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达、研究结构变异及发现新基因等。转录组分析的研究方法、研究平台发生着日新月异的变化,同时生物信息学分析的内容也在逐渐完善。RNA-Seq作为一种新的转录组研究手段,利用新一代测序技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息。主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台,并着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析等及在相关领域的应用等内容,为相关的研究和应用提供参考。

基于RNA-Seq技术筛选影响猪肌纤维性状的候选基因

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,再通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果的准确性。结果显示,马身猪背最长肌肌纤维直径极显著低于大白猪(P<0.01),而肌纤维密度极显著高于大白猪(P<0.01)。转录组测序结果显示,在6月龄马身猪和大白猪背最长肌中,差异倍数在2倍以上的基因共105个,其中,马身猪相对于大白猪上调的基因有55个,下调的基因有50个。GO富集分析表明,差异表达基因主要富集在与线粒体相关的细胞组分和骨骼肌分化有关的生物学过程中;KEGG分析结果显示,这些差异表达基因主要参与到与氧化磷酸化有关的信号途径。qRT-PCR和RNA-Seq对6个DEGs表达情况的检测结果表明它们的表达趋势相同,说明RNA-Seq结果准确可靠。结合差异基因表达丰度、GO和KEGG富集分析结果,本研究发现,MYL3、MYH3、MYH6基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性,ND6基因通过参与线粒体氧化磷酸化过程影响肌纤维类型,MICU2基因通过维持线粒体Ca^(2+)浓度的稳态影响细胞功能,编码转录因子的EGR1和FOS基因通过调节细胞增殖、分化和凋亡等过程影响肌肉生长发育。本研究初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因,为猪肉品质的改善提供了相应的理论依据。

基于BSA-Seq和RNA-Seq方法鉴定大豆抗豆卷叶螟候选基因

豆卷叶螟(Lamprosema indicata Fabricius)是重要的大豆食叶性害虫,挖掘大豆抗豆卷叶螟相关基因对大豆抗虫品种选育和遗传改良至关重要。本研究用大豆高抗豆卷叶螟材料赶泰-2-2和高感豆卷叶螟材料皖82-178进行杂交构建F2代分离群体,从303个F2代单株中挑选出高抗豆卷叶螟和高感豆卷叶螟的单株各30株,分别构建2个极端性状的DNA混合池用于全基因组重测序以分析控制豆卷叶螟相关的候选基因。结果表明,4个样本中共有11,963,077个单核苷酸多态性(SNPs)标记,根据SNP-index方法关联分析,共有329个基因位于99%置信区间外,这些基因主要集中在7号染色体5,601,065~5,865,237 bp区间(总长为0.26 Mb)、16号染色体2,975,110~6,336,096 bp区间(总长为3.36 Mb)、18号染色体44,366,115~54,297,600 bp区间(总长为9.93 Mb)等区域内。将BSA-Seq结果与转录组测序结果进行联合分析发现,有12个基因相关联;最后,结合生物信息学分析、候选基因的表达模式和基因的同源注释,锁定CNGC4、WRKY16转录因子、AAP7、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、ZPR1B等12个基因为控制豆卷叶螟性状相关的候选基因。本研究结果不仅为解析大豆抗豆卷叶螟的分子机理奠定重要的基础,也将为大豆抗虫基因的克隆奠定坚实的理论基础。

基于RNA-seq数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR分子标记

中华蜜蜂是东方蜜蜂的一个亚种,也是我国的特有蜂种。本研究基于已获得的中华蜜蜂幼虫肠道转录组数据预测SSR分子标记,并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的发掘。利用MISA软件对幼虫肠道转录组中数据组装得到的43557条unigenes进行搜索,共预测出13448个SSR位点,它们分布于7763条unigene中,其中最主要的重复类型为二核苷酸重复(58.03%),其次为三核苷酸重复(28.23%)和四核苷酸重复(9.72%)。二核苷酸重复中的基序主要是AT/AT(占总量的30.4%)。对于所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件成功设计出21627对引物,随机选取48对引物对5个不同来源的中华蜜蜂幼虫肠道样品进行SSR位点扩增,共有15对成功扩增出符合预期的目的片段。研究结果表明利用转录组数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR引物是可行的,本研究开发出的SSR引物为研究中华蜜蜂分子遗传学奠定了基础。

利用RNA-Seq发掘玉米叶片形态建成相关的调控基因

【目的】叶片宽度和长度等叶形特性是决定植株形态,进而影响种植密度的重要农艺性状,通过转录组测序技术筛选并挖掘玉米叶片形态建成相关的代谢路径及调控基因,为深入认识叶片发育的分子机理和鉴定叶宽、叶长候选基因奠定基础。【方法】以极端窄叶自交系NL409和宽叶自交系WB665为材料,利用RNA-Seq技术鉴定7叶期第七片叶近基部的差异表达基因(DEGs),通过生物信息学分析,筛选与叶片发育密切相关的代谢通路,利用qRT-PCR验证不同激素路径叶形相关基因的表达结果,并结合启动子区域的序列差异挖掘叶形功能基因。【结果】分析对照(WB665)和样品(NL409)高通量测序结果,在叶宽形成关键部位共筛选出5 199个DEGs,其中,2 264(43.55%)个基因表达上调,2 935(56.45%)个基因下调表达,下调基因明显多于上调基因;GO功能富集分析表明,差异基因主要富集在细胞膜相关的细胞组分中,涉及代谢过程和细胞响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因主要参与到核糖体、植物激素信号转导、苯丙烷类代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等过程,其中核糖体、植物激素信号转导、鞘脂类代谢下调表达基因较多的路径与叶片发育密切相关。核糖体路径富集到多个PRS(PRESSED FLOWER)基因,分析发现PRS13(PFL2)可能在调控窄叶发育过程中发挥重要作用。鞘脂代谢路径富集的基因几乎全部下调表达,引起抑制叶片发育的AP1(APETALA1)类和MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)类基因上调,以及促进叶片发育的LFY(LEAFY)下调,与窄叶发育受抑制的表型一致。植物激素信号转导路径富集到的油菜素内酯(BR)响应基因和赤霉素(GA)代谢基因下调,细胞分裂素(CTK)和大部分生长素(Auxin)响应基因上调,与窄叶中DELLA蛋白基因上调表达,抑制GA并促进CTK基因表达的作用模式一致。通过qRT-PCR对18个叶片发育相关基因进行分析,结果表明,其表达趋势与转录组结果一致,分析发现BR相关的ROT3、Auxin相关的NAL7-like、AGO7-like以及TCP类转录因子CYC/TB1等基因与窄叶的形成密切相关。【结论】明确了一些与玉米叶片发育密切相关的代谢路径,还发现植物激素间的动态平衡对叶片发育有着重要影响,尤其是生长素与油菜素内酯、细胞分裂素与赤霉素之间的相互作用对调控叶片形态可能发挥重要作用。