免疫共沉淀联合质谱技术筛选蓝舌病病毒NS4蛋白的互作蛋白

[目的]筛选蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)NS4蛋白颉颃干扰素(interferon, IFN)信号通路的内源性互作蛋白,以便进一步研究NS4抑制IFN信号转导的作用机制。[方法]在前期仙台病毒(Sendai virus, SeV)诱导IFN信号通路基因表达研究基础上,利用免疫共沉淀方法从转染NS4融合eGFP标签表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP空载体的HEK-293T细胞中钓取NS4互作蛋白,对免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析,免疫共沉淀洗脱液进行质谱鉴定及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白的编码基因表达特征。[结果]通过免疫共沉淀及质谱鉴定分析和数据库比对,共获得189个差异表达蛋白。生物信息学分析结果显示,候选蛋白主要参与蛋白转录、翻译、病毒感染及免疫调控。亚细胞定位分析结果显示,差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质以及胞质-胞核,筛选出4个与BTV NS4蛋白存在互作的候选蛋白:多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)、细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)、N-端豆蔻酰化酶1(NMT1)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SeV刺激72 h后,试验组PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9基因mRNA表达量均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01)。[结论]BTV NS4蛋白颉颃IFN信号通路与PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9蛋白表达上调有关,本试验结果为进一步研究BTV NS4蛋白颉颃宿主天然免疫应答的分子机制提供靶标参考。

建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

目的:建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA(sRNA)提供体内验证方法。方法:首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA——RyhB1和RyhB2。结果:构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA——RyhB1和RyhB2。结论:建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。

免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4相互作用蛋白

为揭示HMGB4在精子发生过程中所起的作用,采用免疫共沉淀技术富集NTera-2细胞中的HMGB4结合蛋白.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取HMGB4结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析,得到相应的肽序列标签(peptide sequence tags,PST).通过搜索数据库在NTera-2细胞系中鉴定到5个HMGB4相互作用蛋白,分别是Pdha1、Keratin 6B、Keratin 5、Actb Actin cytoplasmic 1、RPL18.为进一步研究HMGB4在精子发生机制中的生理功能提供了基础.

红细胞血红蛋白释放实验与免疫共沉淀联用分析人红细胞内血红蛋白与其他蛋白的相互作用

目的:通过红细胞血红蛋白电泳释放实验(ERT)与免疫共沉淀,寻找红细胞内与血红蛋白(hemoglobin,Hb)相互作用的蛋白。方法:首先将正常成人新鲜抗凝全血制备成红细胞悬液和溶血液,通过电泳释放实验分别分离并得到红细胞Hb A(RA)和溶血液Hb A(HA),将此区带从凝胶中分别切出,经过反复冻融后,将上清吸出并进行浓缩,然后用hemoglobinβantibody(37-8)AC通过免疫共沉淀的方法,分别从红细胞裂解液、RA和HA中捕获血红蛋白复合物,然后利用5%-12%的SDS-PAGE分离上述复合物,并用Q-TOF质谱对目的区带进行鉴定。结果:Hb A成分经hemoglobinβantibody(37-8)AC免疫共沉淀捕获的复合物包含有16、20、22、28、50 k D 5条明显的区带,经质谱鉴定分别为血红蛋白、Band 3蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prx2)、Band 3蛋白和β-actin蛋白、Band 3蛋白。结论:在人红细胞内,血红蛋白Hb A可能与Prx-2、Band 3蛋白、β-actin蛋白之间存在相互作用,并形成复合体。

染色质免疫共沉淀分析丁酸钠对γ珠蛋白基因启动子组蛋白乙酰化的作用

目的建立基于Real-time PCR分析的染色质免疫共沉淀(ChIP)方法,探讨丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区组蛋白乙酰化的作用。方法将K562细胞分为0.5 mmol/L丁酸钠处理48 h组和K562细胞组,每组取1×107细胞用实验。采用抗乙酰化组蛋白H3及H4抗体分别对两组细胞进行ChIP,荧光定量PCR分析不同处理细胞Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区乙酰化H3和H4(acH3,acH4)水平。结果各细胞组组内Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3、acH4水平高于阴性对照necdin基因。与K562细胞相比,NaB处理组Gγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.1和2.6倍,Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.7和3.2倍(P<0.01)。结论建立了基于荧光定量PCR分析的ChIP技术用于研究珠蛋白基因启动子区域组蛋白的表观遗传修饰,并进一步证实了丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化的作用。

免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选GBLP相互作用蛋白

为了进一步阐明G蛋白β亚基2样1蛋白(guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP)在普萘洛尔(propranolol,PRO)生物学效应发生机制中的作用,采用免疫共沉淀法结合液相色谱-芯片-离子阱串联质谱(HPLC-CHIP-IT-MS/MS)系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中的GBLP相互作用蛋白.结果表明,有7种蛋白与GBLP存在相互作用,分别为酪蛋白α-S1、酪蛋白α-S2、β酪蛋白、桥粒芯蛋白1前体、α-烯醇化酶、果糖二磷酸醛缩酶C、硫氧还原蛋白过氧化物酶2.这些蛋白的生物信息学检索结果提示,GBLP可能参与了细胞的能量代谢调节和抗氧化机制,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关.

免疫共沉淀联合质谱对肝细胞核因子3β蛋白复合体的分离鉴定

目的:利用免疫共沉淀联合质谱分析方法,在人肝癌细胞系细胞株HepG2内筛选与肝细胞核因子(HNF)3β相互作用的蛋白质。方法:通过免疫共沉淀,用特异抗体分离出HNF3β蛋白复合体,质谱鉴定其成分,NCBI数据库检索各个蛋白质的功能,分析筛选与HNF3β相互作用的蛋白质。结果:利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选到32个与HNF3β相互作用的候选蛋白质,数据库检索发现LMNA与HNF3β具有相同功能注释,参与转录调控。结论:在细胞内HNF3β与多种蛋白质有相互作用,协同参与转录调控,推测HNF3β/LMNA之间相互作用的变化与葡萄糖及脂肪代谢及相关疾病的发生有关。

免疫共沉淀探讨septin蛋白家族间的相互作用

目的 :探讨人肝癌中表达的 3种septin蛋白 1 ,2和6自身之间和相互之间是否存在相互作用关系 ,从而探讨在肝癌中septin家族的作用方式 .方法 :通过构建septin家族基因的pCMV Myc ,pCMV HA表达载体 ,采用人肾 2 93细胞内蛋白的免疫共沉淀进行验证蛋白的相互作用 .结果 :Septin家族蛋白中确实存在着相互作用 ,不仅蛋白相互之间存在相互作用 ,且同一种蛋白质的分子之间也存在着较强的相互作用 .结论

免疫共沉淀结合质谱筛选绵羊BMPR-1B互作蛋白的研究

为研究与绵羊骨形态发生蛋白受体1B(BMPR-1B)相互作用的蛋白,试验通过构建的pcDNA3.1a-BMPR-1B真核表达载体并在Sf9昆虫细胞中特异性表达,采用免疫共沉淀的方法富集绵羊卵巢中与BMPR-1B蛋白的结合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分离免疫共沉淀复合物,MALDI-TOF/TOF结合数据库检索方法筛选鉴定与BMPR-1B相互作用蛋白。结果表明,试验获得的GDF5、BMP2、BMP4、RhoD和HSP 10蛋白与BMPR-1B互作,GDF5和BMP4作为BMPR-1B蛋白的配体来发挥其生物学功能,BMP2、RhoD和HSP 10在卵泡发育上起重要作用。RhoD和HSP 10与棉羊繁殖主效基因相关联。研究结果为进一步研究BMPR-1B的功能和研究BMPR-1B作为绵羊高繁主效基因的机理和分子调控机制提供了新的思路与方法。

利用免疫共沉淀验证抗增殖蛋白与HSP70的相互作用

目的利用免疫共沉淀技术验证抗增殖蛋白(PHB)与HSP70间的相互作用,为研究应激时HSP70促进PHB进入线粒体的机制提供科学依据。方法采用Western blot方法检测HEK293细胞中PHB与HSP70的表达。构建抗增殖蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PHB,经酶切鉴定正确后,将其转染HEK293细胞,采用荧光倒置显微镜观察转染效率。收集转染的HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术验证PHB与HSP70之间的相互作用。结果在HEK293细胞中,HSP70具有较高的表达量,而PHB的表达量非常低。构建了抗增殖蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PHB,转染HEK293细胞的效率达到90%以上。在抗体沉淀的PHB相互作用蛋白复合物中,可以检测到HSP70的存在。结论构建了抗增殖蛋白融合蛋白真核表达重组载体,在HEK293细胞中高表达抗增殖蛋白后,利用免疫共沉淀技术证实PHB与HSP70之间存在相互作用。

免疫共沉淀联合质谱技术筛选柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3互作蛋白

为探究柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(EtCDPK3)在钙离子信号通路中是如何将信号传递给下游效应分子,进一步促进虫体入侵宿主细胞的机制,以柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白及其单克隆抗体和多克隆抗体为实验材料,利用免疫共沉淀技术筛选EtCDPK3的互作蛋白并进行质谱鉴定分析,使用Maxquant软件对获得的原始数据进行分析。SDS-PAGE结果显示,与阴性对照组相比,2个样品组出现差异条带;免疫共沉淀洗脱液质谱鉴定分析结果显示,获得6个可能与EtCDPK3相互作用的相关蛋白。以上实验结果为进一步深入研究EtCDPK3在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中的作用奠定基础。

通过对免疫共沉淀技术的优化验证蛋白质弱相互作用

采用单因子法对影响免疫共沉淀结果的各因素进行优化.以hCLP46(humanCAP10-like protein46)蛋白和内质网分子伴侣calnexin为例,对相互作用开展研究.通过对细胞裂解液各组分浓度、抗体用量、hCLP46的蛋白量和交联剂DSP因素的优化,验证了hCLP46(human CAP10-like protein46)蛋白和内质网分子伴侣calnexin间的弱相互作用.研究结果为探讨蛋白质之间弱相互作用提供一定的参考价值.

免疫共沉淀联合质谱分析筛选克罗恩病中Intelectin-1相互作用蛋白的初步研究

目的对比克罗恩病患者的病变与正常肠黏膜,筛选与肠凝集素-1(Intelectin-1)相互作用的差异蛋白,探讨Intelectin-1及其相互作用蛋白在克罗恩病发展中的作用。方法利用免疫共沉淀技术筛选克罗恩病患者病变及正常组织中与Intelectin-1相互作用的蛋白;利用MALDI-TOF/TOFMS质谱分析技术鉴定与Intelectin-1相互作用蛋白;并使用免疫共沉淀和Western blot分析技术验证所鉴定的Intelectin-1相互作用蛋白。结果利用免疫共沉淀联合质谱分析技术成功筛选出4个与Intelectin-1相互作用差异蛋白,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)、腺苷酸三磷酸酶(ATPase)、热休克蛋白90(HSP90)、锌指蛋白(ZNF)。结论Intelectin-1可能通过与TRAF3、ATPase、HSP90、ZNF蛋白相互作用,而影响克罗恩病的发展。

TXNDC5蛋白在胃癌细胞及组织中相互作用蛋白的免疫共沉淀验证

目的 我们前期通过串联亲和偶联蛋白质组学技术成功地筛选出胃癌细胞SGC7901中与TXNDC5相互作用的蛋白质,在这些蛋白质中除去功能意义较为明确的蛋白,TXNIP、PRDX2、PDCD4和ADIPOR1可能在肿瘤发生发展中具有一定作用,但其具体分子作用机制尚不清楚。本研究进一步验证在胃癌组织和细胞中TXNDC5蛋白与上述蛋白的关键相互作用。方法 以pcDNA3.1为基础构建pcDNA3.1-TXNDC5真核表达载体,并以此载体瞬时转染人胃癌SGC7901细胞,RT-PCR法及Western blotting法检测TXNDC5蛋白表达。采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)法验证TXNDC5高表达细胞系中其与TXNIP、PRDX2、PDCD4、ADIPOR1的相互作用。取人胃腺癌新鲜手术标本提取总蛋白,采用Western blotting法检测TXNDC5蛋白表达,选取确认为TXNDC5高表达的胃癌组织总蛋白采用Co-IP验证TXNDC5与TXNIP、PRDX2、PDCD4、ADIPOR1的相互作用。结果 通过Co-IP法验证,TXNDC5高表达胃癌细胞系中,TXNDC5与TXNIP、PRDX2、PDCD4存在相互作用;TXNDC5高表达胃癌组织中,TXNDC5与TXNIP、PDCD4存在相互作用。结论 本研究通过Co-IP技术成功地验证了胃癌细胞和组织中TXNDC5与TXNIP、PDCD4存在相互作用,提示TXNDC5在胃癌中的促癌分子机制可能通过与TXNIP和PDCD4相互作用影响其相关信号通路有关。

免疫共沉淀法测定14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用

目的研究14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用及其作用位点,为小鼠卵母细胞减数分裂G2期阻滞的机制研究提供实验依据。方法本实验依次构建pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Ser321A、pEGFP-Cdc25B-Ser321D表达载体,分别转染HEK293细胞,分为四组,分别为Cdc25B-vector+14-3-3ε组(空载体组),Cdc25B-WT+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321A+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321D+14-3-3ε组。通过免疫共沉淀法获得各组细胞裂解液及免疫沉淀物,用Western blotting检测Cdc25B-vector、Cdc25B-WT、Cdc25B-Ser321A、Cdc25B-Ser321D与14-3-3ε蛋白是否有共沉淀,如有共沉淀,说明两蛋白存在相互作用。结果本实验构建的4种表达载体经验证均构建成功。免疫共沉淀实验得出14-3-3ε能与野生型Cdc25B结合,当Cdc25B的S321突变成S321A时,这种结合不发生;而具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S321D也能与14-3-3ε结合。结论Cdc25B S321是14-3-3ε蛋白与Cdc25B相互作用的特异性结合位点,此结合位点可能成为14-3-3ε蛋白与Cdc25B共同调控小鼠卵母细胞减数分裂进程及G2期阻滞的重要靶点,为后期哺乳动物生殖细胞的相关研究奠定实验基础。

长爪沙鼠NAFLD模型中CIP4基因的表达及与β-catenin蛋白相互作用的免疫共沉淀验证

目的获得长爪沙鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型中CDC42作用蛋白4(CIP4)基因的表达规律及是否受β连环蛋白(β-catenin)调控的证据。方法3月龄雄性长爪沙鼠30只采用随机数字表法分为正常组6只和模型组24只,模型组按饲喂高脂饲料的时间不同分为2周组、4周组、8周组、12周组,每组6只。按组采集肝脏大叶标本4份,HE染色及Masson染色检测肝脏的病理变化,荧光定量PCR(qPCR)法检测CIP4 mRNA相对表达量,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测CIP4蛋白相对表达量,免疫共沉淀(CoIP)验证CIP4与β-catenin的相互作用。结果肝病理学检测结果显示,随着造模时间的延长,模型组沙鼠均出现肝脏脂肪病变(单纯脂肪肝,2~4周造模,S0~S1),脂肪性肝炎(4~8周造模,脂堆积形成肝细胞的肿胀,坏死和空泡,少量纤维化出现,S1~S2),肝纤维化(8~12周造模,S2~S3),部分有假小叶形成。qPCR和Western blot结果显示,随着造模时间延长,CIP4 mRNA和蛋白相对表达量均下降。模型组被CoIP下来的CIP4蛋白明显下降,这表明模型组β-catenin与CIP4的相互作用减少。结论随着NAFLD病程的进展,长爪沙鼠模型CIP4呈现降低趋势,其作用受β-catenin的调控。

免疫共沉淀结合双向电泳分离相互作用蛋白质的方法优化

目的:建立和优化有针对性的免疫共沉淀(CO-IP)与双向电泳(2DE)-质谱联合的技术来鉴定相互作用蛋白质。方法:利用特异性抗体通过CO-IP对细胞全蛋白中的目标蛋白进行富集,用不同洗脱液洗脱目标及其相互作用蛋白,并行2DE分离。结果:对CO-IP过程、洗脱液成分、上样量等关键步骤进行优化,得到满意的2DE图谱。结论:成功优化CO-IP与2DE分离技术,为通过蛋白质组学研究信号通路中重要蛋白质的相互作用提供有效方法。

微小RNA-30a调控丝裂原活化蛋白激酶通路对主动脉夹层大鼠的影响

目的探讨微小RNA(miR)-30a调控MAPK通路对主动脉夹层大鼠模型夹层形成、炎性因子及血管收缩的影响。方法选取SD大鼠50只,建立主动脉夹层大鼠模型,将其随机分为对照组、模型组、miR-NC组、miR-30a组、miR-30a抑制剂组,各组10只。组织病理学染色观察大鼠主动脉组织变化、主动脉中膜弹力纤维与胶原纤维变化;采用PCR、尾动脉压力计、ELISA法对各组miR-30a表达、干预前后收缩压情况、血清炎性因子表达进行检测;采用Western blotting检测各组大鼠基质金属蛋白酶(MMP)-6、MMP-2蛋白表达以及MAPK通路相关蛋白表达。结果MiR-30a抑制剂组血管壁撕裂程度和内动脉壁排列紊乱有所改善;miR-30a抑制剂组改善血管重构;与对照组相比,模型组miR-30a表达较高,与miR-NC组相比,miR-30a组、miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05;干预前,各组收缩压比较差异无统计学意义,P>0.05;与对照组相比,模型组收缩压较高,与miR-NC组相比,miR-30a组表达较高,miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05;与对照组相比,模型组肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β表达较高,与miR-NC组相比,miR-30a组表达较高,miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05;与对照组相比,模型组、MMP-6、MMP-2、Ras、Raf、P38 MAPK及ERK1/2蛋白表达较高,与miR-NC组相比,miR-30a组表达较高,miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05。结论MiR-30a参与主动脉夹层的形成、炎症反应、调控主动脉夹层血管重构,可能是通过调控MAPK信号通路实现的。

C6/36细胞上登革2型病毒受体的免疫共沉淀

本文利用差速离心方法提纯的登革2型病毒、抗登革病毒单抗、病毒受体、耦合有G蛋白的琼脂糖珠之间特异性结合的作用,利用免疫共沉淀方法从C6/36细胞中分离鉴定出分子量约为35kDa受体蛋白;并用糖蛋白染色方法否定了此蛋白的糖基化特征。

免疫共沉淀技术的研究进展

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。