基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术检测EV-A71 RNA及其与病毒3D聚合酶的相互作用

RNA荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术利用荧光标记的核苷酸探针,通过互补链杂交,对细胞或组织中特定的RNA序列进行检测和定位。由于RNA-FISH产生的阳性信号较弱,需要结合特异性信号放大,提高信噪比。但传统信号放大技术的背景难以消除,无法定量且分辨率低,是RNA-FISH技术应用的巨大障碍。本文基于第3代杂交链反应(hybridization chain reaction version 3.0,HCR v3.0),利用一对分裂式探针消除非特异杂交背景,并引发荧光信号放大反应,建立了针对肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)RNA的敏感、特异的FISH检测方法,并将该技术与蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结合,通过高分辨率激光共聚焦成像,成功地在单个细胞水平上检测了EV-A71感染细胞后病毒RNA与其聚合酶3D蛋白的分布变化和相互作用情况,并对细胞中病毒RNA和3D蛋白进行定量。发现相较于传统定量方法,如逆转录定量聚合酶链反应和免疫印迹,新一代RNA-FISH技术在单个细胞水平上病毒RNA和3D聚合酶的表达情况与群体细胞检测的结果在趋势上有明显差异。这说明,基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术,可以克服群体细胞数量增减掩盖病毒组分变化的缺点,从而真实反映病毒在单个细胞中的变化。

IBDV逆转录-聚合酶链反应和核酸杂交检测方法的研究

以建立的传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和核酸杂交检测方法，检测了细胞培养物、病理组织、粪便和饲料中的ＩＢＤＶ，并与ＩＢＤＶ夹心ＥＬＩＳＡ、琼脂扩散试验（ＩＤ）和病毒分离方法进行了平行比较试验。结果表明，ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交检测方法具有高度的敏感性和特异性，是深入研究ＩＢＤ流行病学。

聚合酶链反应结合探针杂交检测军团菌

利用来源于嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强因子（ｍｉｐ）基因序列的引物，建立了快速检测军团菌的聚合酶链反应技术。扩增反应产物经与地高辛标记的特异寡核苷酸探针杂交证实。用本方法检测接种过军团菌的支气管肺泡灌洗液标本，可检出１００ＣＦＵ／ｍｌ细菌。研究表明它是军团病诊断的一种有效手段。

聚合酶链反应-微孔板杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌

目的评价聚合酶链反应 (PCR) -微孔板杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌的价值。方法 :应用结核病细菌学涂片、培养常规检测方法及PCR -微孔板杂交技术检测 138例结核病患者痰标本 ,4 2例非结核呼吸系统疾病患者痰标本。结果 :用常规细菌学方法检测临床标本中结核杆菌敏感度为 37% (5 1/ 138) ,用PCR-微孔板杂交技术检测敏感度为 5 6 % (77/ 138) ,高于常规检测法 19%。用PCR -微孔板杂交技术检测临床标本特异性为 10 0 %。结论 :PCR -微孔板杂交技术将PCR扩增、核酸杂交的技术及酶免技术相结合 ,简便、快速、敏感度高、特异性强 ,是结核病辅助诊断的有效方法之一。

双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定

构建双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库,并对文库质量进行鉴定。采集未经免疫的6月龄雌性双峰驼外周血、骨髓、脾和淋巴结,并从外周血中分离淋巴细胞。抽提总RNA,反转录为cDNA,用2对引物经过2轮PCR扩增得到400bp左右的双峰驼VHH片段。根据Clontech公司Mate&PlateTMlibrary construction system使用手册,将带有同源臂的VHH片段与线性化的pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母感受态细胞,转化产物涂布SD/-Leu平板,30℃倒置培养3~5d后,收集平板上的所有克隆,即为双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库。对文库的滴度、重组效率及多样性进行鉴定。结果显示,本研究构建的双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库库容为2.07×107,滴度为7.6×108cfu·mL-1。随机挑取47个独立克隆进行菌落PCR鉴定,43个含有VHH片段,重组率为91.5%;选取其中19个测序,均为独立克隆,且多样性好。该研究成功构建双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库,且文库质量满足要求,为进一步获得特定抗原的VHH奠定了基础。

多重聚合酶链反应和反向线性点杂交技术在常见呼吸道病毒检测中的应用

目的应用多重聚合酶链反应(mPCR)扩增基因技术和反向线性点杂交技术(RLB)相结合的方法从基因水平建立常见呼吸道病毒的检测方法。方法根据常见的7种呼吸道病毒包括流感病毒A,副流感病毒1、2、3型,腺病毒1型,呼吸道合胞病毒A、B型的特点设计特异性的引物和探针,应用mPCR/RLB技术对常见的7种病毒株进行检测,建立研究方法。结果使用特异性引物对7种病毒株的基因进行mPCR,均得到相应的目标扩增产物,扩增条带清晰,与目标片段一致。7种病毒株的PCR产物与特异性探针杂交,均可得到清晰的杂交模式,并且彼此之间没有交叉反应,与作为阳性对照的细菌标准菌株亦没有交叉反应。结论 mPCR和RLB相结合是从基因水平检测常见呼吸道病毒的方法 。

聚合酶链反应结合斑点杂交技术检测伤寒沙门氏菌的临床应用研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增伤寒沙门氏菌鞭毛抗原基因Ⅵ区一段特异性的ＤＮＡ片断，再用地高辛标记探针与之杂交检测，并用非伤寒沙门氏菌作对照，结果仅伤寒沙门氏菌阳性。实验表明，当标本中伤寒沙门氏菌含量达１０ｃｆｕ／ｍｌ时，即可检出。在伤寒发病早期，当机体抗体水平尚处于低水平时，应用ＰＣＲ斑点杂交检测伤寒沙门氏菌可提高伤寒的诊断率；在伤寒病程后期，应用ＰＣＲ斑点杂交检测治疗后带菌状态具有重要价值。

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应(PCR)与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)2种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77%,总一致性指数(Kappa指数)为0.538。其中,高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组二者的符合率为82%,Kappa指数为0.410,一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。

聚合酶链反应—微孔板杂交技术检测人乳头瘤病毒

目的 建立HPV诊断及分型技术。方法 用HPV通用型引物和型特异性探针作PCR 微孔板杂交检测法(PCR ELISA)。结果 特异性探针只与HPV阳性标本显色 ,A值为 0 32 7± 0 0 2 9;阴性标本均不显色 ,A值为 0 0 0 3± 0 0 0 1,与性传播性疾病相关的病原微生物 (淋球菌、解脲支原体、沙眼衣原体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒 )均不显色。该法能检出 3 6个HeLa细胞含HPV 18型 144个拷贝 ,A值 0 2 37～ 0 2 0 6 ;空白对照A值为 0 0 0 5～ 0 0 15。结论 PCR ELISA方法快速、敏感、特异且可用自动化酶标仪多量标本检测 ,适合临床实验使用。

聚合酶链反应-探针杂交-酶显色用于结核分支杆菌的检测

目的 评价聚合酶链反应 探针杂交 酶显色方法 ,检测结核分支杆菌。方法 收集 131例活动性肺结核患者和 30例非结核呼吸系疾病患者的痰标本以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查 ,结核菌培养、PCR 探针杂交 酶显色法、PCR 琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。结果 涂片法、培养法、PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性分别为 2 6 72 %、4 1 2 2 %、70 2 3% ,PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性显著高于培养法和涂片法 (P <0 0 1)。PCR 探针杂交 酶显色法和PCR琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为 70 2 3%、70 99% ,特异性分别为 96 6 7%、86 6 7% ,前者特异性比后者高 ,且PCR 探针杂交 酶显色法只检出结核分支杆菌和牛型分支杆菌。结论 PCR 探针杂交 酶显色技术检测结核分支杆菌灵敏度高 ,特异性好 ,简便快速 ,同时能筛检非结核分支杆菌。因此 。

聚合酶链反应-微孔板杂交作人乳头瘤病毒新亚型分子流行病学研究

目的 了解人乳头瘤病毒 (HPV)新亚型 (注册号 :AF2 76 910 )的分子流行病学特点。方法 PCR 微孔板杂交检测泌尿生殖道标本、宫颈癌石蜡包埋组织、胃癌组织中HPV新亚型 ,结合临床特征了解其致病特点。结果 2 0 2例经HPV通用引物筛查阳性的泌尿生殖道标本中 ,2例HPV新亚型阳性 ,占 0 .1% ;5 1例宫颈癌石蜡包埋组织中 ,3例HPV新亚型阳性 ,占 5 .9% ;15例胃癌组织 ,未测到HPV新亚型。结论 早在 5年前本地区HPV新亚型就已存在 ;HPV新亚型在宫颈癌组织中被测到 ,可能提示其有致癌作用 ,值得进一步研究。

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的 建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交 聚合酶链反应 (PCR)方法。方法 利用TaqDNA聚合酶的 5’ 3’核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针 ,导致荧光强度的改变 ,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物。结果 选用 13株常见致病性沙门菌和 7株非沙门菌进行特异性分析 ,所有沙门菌的荧光△RQ值介于 3～ 8之间 ,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于 1;在敏感性分析中 ,采用菌落CFU计数法 ,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含 2 .2 5CFU的沙门菌 ;与传统细菌培养鉴定方法对照 ,对 4 0份各种标本进行沙门菌的检测 ,结果该方法的特异性为 10 0 % ,敏感性为 93.1% ,两种方法的符合率为 95 %。结论 用荧光探针杂交 PCR检测沙门菌 ,是一种快速。

乙型肝炎病毒聚合酶链反应液相杂交酶免疫检测的定性判断值研究

目的探讨乙型肝炎病毒 (HBV)聚合酶链反应 (PCR)液相杂交酶免疫检测的定性判断值设立和灰区范围的计算方法。方法以 HBV为目的靶 DNA,引物 P1 5’端标记 Bio,PCR扩增 35个循环。扩增产物与 5’端标记Dig的探针混合进行液相杂交 ,杂交后产物被 SA酶标板固定 ,经酶标记抗 Dig抗体结合、显色。结果实验结果显示 ,本试剂的检测敏感度在 3× 10 4拷贝 /m l。 3种参比品 A450 值的 95 %、99%分布范围之间不存在交叉区 ,其中临界阳性参比品 95 %分布范围下限值 (A450 )为 0 .182。 5 85例献血员血清标本的 A450 均值为 0 .0 37,P99上限值为 0 .12 3,灰区范围在 0 .12 3～ 0 .182。本试剂对“HBs Ag+/HBe Ag+/抗 - HBc+”标本的阳性检出率为 98.8% ,“HBs Ag+/抗 - HBe+/抗 - HBc+”标本的检出率为 5 4.8% ,阴性标本的检测有较高的特异性。结论本试剂设立的定性判断值(灰区计算方法 )具有很高的正确性。

应用抑制性消减杂交技术研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达

目的 :研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达。方法 :常规方法建立大鼠热适应模型 ,分别从正常大鼠及热适应大鼠肝脏细胞中提取总RNA并抽提mRNA ,按照SSH常规操作方法 ,构建cDNA消减文库 ,筛选阳性克隆并加以鉴定以得到带有差异表达基因的克隆。结果 :成功构建具有高消减效率的热适应大鼠肝脏细胞cDNA消减文库 ,筛选鉴定后发现 6个克隆含有差异表达基因。测序结果显示其中 3个分别为热休克蛋白基因Hspel、线粒体细胞色素氧化酶C亚单位和NADH脱氢酶亚单位Ⅲ基因ND3。结论 :三种基因的差异表达证明了线粒体呼吸链功能的增强在细胞的代偿功能中的重要作用 ,线粒体在热适应时动物体对高温的代偿性反应中发挥着参与热耐力形成、提高机体抗热损伤能力的重要作用。

反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌

目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法。方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测。结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10ng细菌DNA。50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份。结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义。

分泌抗人IgMμ链单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用杂交瘤技术建立了6株分泌抗人IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株.经琼脂糖双扩散试验、双扩散和ELISA封闭试验,以及免疫电泳等方法证实,所分泌的抗体具有抗人IgMμ链特异性.其中4株分泌IgG_1亚类、2株分泌IgG_2a亚类抗体.经一年多的反复冻存和复苏,这6株细胞均能稳定分泌高效价抗体.

β地中海贫血多突变位点多聚酶链反应与反向斑点杂交基因分析

目的 :研究 38例 β地中海贫血 (β地贫 )基因突变类型以及与临床表型的相关性。方法 :采用PCR/反向斑点杂交 (PCR/RDB)技术同时检测 11种 β地贫基因突变位点 ,并对所有病例作血液学分析和临床资料收集对比。结果 :本组病例共检出 7种基因突变类型 ,涉及 46个位点突变 ,包括 4种常见类型 (35 / 46 ,76 1% ) ,三种罕见类型 (11/ 46 ,2 3 9% )。 32例轻型 β地贫中 ,30例为基因突变杂合子 ,2例是双重基因突变子 ;6例重型 β地贫中 ,5例为基因双重突变子 ,1例是基因突变杂合子。结论 :β地贫基因突变复杂多样 ,双重基因突变子多为重型 β地贫 ,但亦见于少数轻型 β地贫。多突变位点PCR/RDB基因技术快速、特异 ,适用于

间期荧光原位杂交检测多发性骨髓瘤13号染色体长臂缺失和免疫球蛋白重链基因易位

目的探讨多发性骨髓瘤（MM）患者13号染色体长臂缺失[del（13q）]和免疫球蛋白重链（IGH）基因易位[t（14q）]的临床价值。方法采用直接免疫磁珠法分选骨髓瘤细胞,应用间期荧光原位杂交（FISH）技术对24例MM患者进行del（13 q）和t（14 q）的检测。结果11例（45.83%）为del（13 q）、9例（37.50%）为t（14q）,5例（20.83%）为两个位点均异常、15例（62.50%）为至少1个位点异常。单因素分析显示,治疗有效组（n=14）del（13q）的阳性率为35.71%、无效组（n=9）为66.67%,两组比较差异无显著性（P=0.214）;治疗有效组t（14q）的阳性率为21.43%、无效组为66.67%,两组比较差异无显著性（P=0.077）。多因素分析显示,del（13q）（OR=5.761,95%CI 0.500-66.391,P=0.160）、t（14q）（OR=6.576,95%CI 0.580-74.614,P=0.129）和校正血清钙水平（OR=8.080,95%CI 0.738-88.427,P=0.087）是相对独立的、影响MM疗效的负性因素。结论间期FISH是一种检测MM患者骨髓瘤细胞突变的敏感方法,具有临床应用价值。del（13q）、t（14q）以及校正血清钙水平对判断临床疗效和预后具有指导作用。

聚合酶链反应结合斑点杂交测定乙型肝炎病毒DNA的评价

分别以Ｄｏｔｂｌｏｔ，ＰＣＲ－ＥＢ，ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ法测定了１４６例慢性乙型肝炎患者血清ＨＢＶＤＮＡ。结果显示在ＨＢｅＡｇ组，ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ阳性率（１００％）显著高于ＰＣＲ－ＥＢ（９４．８％），在ＨＢｅＡｂ组，ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ的检出率为５４％，ＰＣＲ－ＥＢ为３８％。两者总检出率分别为８４．２％和７５．３％，统计学处理差异显著。有３例ＰＣＲ－ＥＢ再现生信号。

应用克隆杂交和聚合酶链反应技术检测TDH基因

目的建立快速、敏感、特异和精确的方法检测致病性副溶血弧菌（ＶＰ）。方法在耐热 溶血毒素（ＴＤＨ）结构基因序列的基础上，自行设计探针和引物，应用克隆杂交方法检测３０株不同 来源的ＶＰ，同时对１０株不同ＫＰ反应的ＶＰ ＤＮＡ行ＰＣＲ－ＴＤＨ检测。结果３０例实验菌株，２６ 例ＫＰ阳性株克隆杂交出现阳性信号，其余４例杂交阴性（２例ＫＰ弱阳性、２例ＫＰ阴性）。用ＰＣＲ 检测的１０株ＶＰ中，６例ＫＰ阳性株ＴＤＨ基因均阳性，但有１株ＫＰ弱阳性和１株ＫＰ阴性株也呈 ＴＤＨ基因阳性。ＰＣＲ阳性结果均用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法证实。结论应用克隆杂交技术检测ＴＤＨ基 因在合适的条件下能有效地鉴别致病性与非致病性ＶＰ。 ＰＣＲ检测ＴＤＨ基因为研究ＶＰ的致病机 理奠定基础，在临床上可作为一种检测致病性ＶＰ的快速敏感的初筛试验。