梨ACC氧化酶基因(ACO)的片段克隆及其RNAi载体构建

以若光梨成熟果实为材料,提取总RNA,在ACC氧化酶基因(ACO)cDNA序列同源性较高区域设计一对特异引物,利用RT-PCR克隆了ACC氧化酶(ACO)基因片段。将ACO反义基因、与副球菌中类胡罗卜素合成有关的间隔基因YYT和ACO正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中,构建成能够表达ACC氧化酶基因的双链RNA的植物载体pYF028,为耐贮砂梨的遗传转化创造条件。

多浆旱生植物霸王质膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因RNAi载体构建

以多浆旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)幼苗根系为材料,采用RT-PCR方法获得了其质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxSOS1的片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体PART27为基础,采用酶切连接的方法构建了CaMV 35S启动子驱动的含ZxSOS1基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体PARS,为利用RNAi技术深入研究ZxSOS1在霸王体内Na+转运中的功能及其在霸王适应干旱生境中的作用机制奠定基础。

野生罂粟BBE基因克隆及RNAi载体构建

以野生罂粟(Papaver somniferum)试管苗幼叶为材料,用Trizol试剂盆提取总RNA,通过RT-PCR法获得BBE基因的cDNA片段,序列分析表明,所获得的cDNA序列全长1 608 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码536个氨基酸,经blast检索该片段与GenBank中的小檗碱桥酶基因BBE(AF025430)同源性为94.84%.以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含小檗碱桥酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARB,为培育低吗啡,高蒂巴因的罂粟新品系奠定了基础.

盐生植物小花碱茅CYP86A基因的RNAi载体构建

拒盐型盐生植物小花碱茅根系具有高度木栓化的内皮层可能是其抵御盐胁迫的重要策略之一。本研究以盐胁迫下小花碱茅幼苗的根为材料,采用RT-PCR方法扩增到木栓质生物合成关键基因CYP86A的RNAi靶片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切连接结合In-Fusion的克隆方法成功构建了以35S启动子驱动,含PtCYP86A基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARC,为利用RNAi技术深入探究根系木栓化在小花碱茅拒盐中的功能奠定基础。

马蔺重金属ATP酶基因HMA 2的RNAi载体构建及其遗传转化

重金属ATP酶基因HMA2介导的Cd长距离运输对植物体内Cd的分配及解毒起重要作用。然而,有关马蔺(Iris lactea)体内Cd长距离运输的分子机制仍不清楚。本研究以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有IlHMA2基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARTG1G2,用冻融法将此重组质粒导入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了IlHMA2-RNAi转化株系。这将为阐明IlHMA2介导的Cd长距离运输在马蔺适应重金属镉污染环境中的作用机制奠定基础。

烟草马铃薯Y病毒病相关基因eIF4E的片段克隆及RNAi载体构建

以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子双链RNA(dsRNA)为目标,以感病烟草品种为材料,提取总RNA,根据已报道的eIF4E基因的核苷酸序列,在保守区域和差异区域分别设计特异性引物,采用RT-PCR克隆出eIF4E基因的目的片段。将正向目的基因用XbaⅠ和ClaⅠ切下,将所得基因片段与用同样酶切开的含内含子的载体pKAN相连,取名pK-S;用同样的方法,将反向目的基因用XhoⅠ和KpnⅠ切下,所得基因片段与用同样酶切开的pK-S相连,取名pK-SA,再用NotⅠ将包括Intron和正反向基因在内的片段切下,将其定向插入同样酶切开的pART27上,获得重组质粒。以中间载体pKANNIBAL和表达载体pART27为基础,构建成以CaMV35S启动子为驱动的含有"正向eIF4E目的片段-pdkintron-反向eIF4E目的片段"的RNAi烟草表达载体,获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。

山黧豆CASase基因的克隆及RNAi载体的构建

β-腈基丙氨酸合成酶(CASase)是调控山黧豆(Lathyrus sativus)内源毒素β-ODAP合成的关键酶。本研究以山黧豆幼根RNA为模板,利用RT-PCR扩增了505bp的山黧豆CASase基因序列;通过Gateway BP反应将扩增片段连接到入门载体构建pENTR-CASase。经测序验证后,将目的片段插入到植物表达载体构建pSGRNAiCASase,并将其转化到农杆菌GV3101中;为进一步的遗传转化奠定了基础。

桃蚜MpAChE基因RNAi表达载体构建及转化

通过害虫取食植物表达害虫发育关键基因dsRNA的转基因植株,分析能否通过抑制害虫特定基因的表达来防控害虫。本研究利用RT-PCR技术从桃蚜中克隆乙酰胆碱酯酶基因383 bp cDNA片段,命名为MpAChE。进一步利用该MpAChE基因片段构建植物RNAi表达载体RNAi-MpAChE,并通过浸花法转化野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性筛选转化植株,PCR及Southern杂交进一步鉴定转基因植株。结果表明:克隆的cDNA片段与桃蚜中已克隆的乙酰胆碱酯酶(GenBank登录号AY147797)cDNA序列核苷酸一致性为99%。卡那霉素抗性初步筛选和PCR进一步鉴定,获得25株阳性转基因植株。从25株中随机选择的5株阳性植株,Southern杂交均为阳性。经接种桃蚜初步鉴定,转基因植株对蚜虫的抗性效果不显著。

盐生植物小花碱茅外整流K^+通道PtSKOR基因的克隆及RNAi载体构建

为研究盐生植物小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)耐盐的分子机制,本研究根据已克隆到的Pt SKOR基因片段,利用RACE技术得到小花碱茅Pt SKOR的3'和5'c DNA序列,拼接后的基因全长为2 353 bp,编码715个氨基酸,系统进化分析显示Pt SKOR编码外整流K+通道。在此基础上,采用酶切连接的方法,构建了Ca MV 35S启动子驱动的含Pt SKOR基因片段反向重复序列的Pt SKOR-RNAi植物表达载体。

两步法构建灰飞虱RNAi载体及水稻遗传转化

灰飞虱不仅直接危害水稻,还是水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病的传播媒介。为了探索防治灰飞虱及由灰飞虱引起的水稻病毒病的方法,本研究利用两步法快速高效构建灰飞虱RNAi载体,并应用于水稻遗传转化。针对灰飞虱的激活性蛋白激酶C受体(RACK)基因设计了一对特异性引物,通过PCR扩增一段200 bp的干扰片段,将干扰片段克隆到入门载体p ENTR,再经过LR反应使入门载体上的干扰片段整合入目的载体p ANDA,形成RNAi载体p ANDA-RACK,通过农杆菌EHA105介导的水稻转化法转入武陵粳1号,获得20株经鉴定为阳性的转基因植株,为防控灰飞虱及其传播的水稻病毒病提供了珍贵材料。

紫花苜蓿MsZIP基因RNAi表达载体的构建及苜蓿转化

根据已经得到的MsZIP基因序列(GenBank序列号:HQ911778),设计两对含有酶切位点的引物ZIPF1/ZIPF2和ZIPR1/ZIPR2,合成用于构建干扰载体的正反义片段。将正反义片段插入到载体pART27中,构建成为含有发夹结构的RNAi干扰载体pART-F-R。采用农杆菌介导的方法,将该干扰载体成功转化到苜蓿中,得到9株抗性苗,选取其中的3株进行PCR鉴定,结果表明成功得到转基因苜蓿。

水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析

采用RT-PCR法亚克隆了PDI基因保守区内450bp的靶标序列作为干扰区段,构建了含有内含子hpRNA(ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株;通过在T0代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定,确定携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中,且在转基因T1代符合3∶1的分离模式。半定量PCR和荧光定量PCR的检测结果表明,PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显著降低,尤其是其籽粒中表达量较微,几乎能引起靶基因80%左右沉默。对转基因T2代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果,PDI基因沉默会引起高温胁迫处理下结实率的大幅度降低,耐热性显著下降,但其在常温处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外,PDI基因沉默后,稻米的透明度下降、垩白度增加,但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。

烟草orf25基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

杂种优势的利用可以有效地实现烟草高产、高抗、优质的育种目标,目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。研究发现orf25基因位于线粒体基因组中,与烟草雄性不育密切相关。本研究以烟草雄性不育相关基因orf25为研究对象,根据RNA干扰载体构建原则,将长度为606 bp的orf25基因干扰片段分别以正向、反向连接到大小为190 bp的linker连接片段的两侧,构成发夹结构的RNA干扰载体片段。将RNA干扰载体片段插入到中间载体pET30a上,最后克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建orf25基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi转入到烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%。结果表明pCAMBIA1301-orf25-RNAi干扰载体已成功转入到烟草中烟90中。

野生罂粟COR基因克隆及转化

以野生罂粟幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到可待因酮还原酶基因COR的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长966 bp,具有完整的ORF,编码321个氨基酸。Blast分析表明,该片段与GenBank中的可待因酮还原酶基因(COR)家族相似性很高,其中与基因COR1.1的一致性最高可达98.96%,该片段命名为COR(GenBank,登录号为FJ624147)。以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含可待因酮还原酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARC,转化烟草获得转基因植株。

天山雪莲根边缘细胞特异蛋白BCsp基因的克隆及转化

根据石河子大学农业生物技术重点实验室天山雪莲cDNA文库单克隆测序结果,发现编号为123的单克隆具有1个843 bp的完整的ORF,编码281个氨基酸。B1astx分析表明该cDNA编码的蛋白与豌豆根边缘细胞特异蛋白具有很高的同源性,且具有相同的结构域,命名为BCsp(暂无登录)。以cDNA文库单克隆为模板,通过PCR克隆得到BCsp。以中间载体pUCCRNAi和植物表达载体pCAM2300-35S-Ocs为基础,成功构建了植物RNAi表达载体pCAB,转化天山雪莲愈伤组织获得转基因雪莲苗。

盐胁迫条件下转录因子RAP2L14调控杨树生长研究

[目的]ERF(ethylene response factor)转录因子家族基因能够调控植物应答高盐等逆境胁迫,参与植物生长发育等生物学过程。RAP2L14是ERF转录因子家族重要成员,本研究旨在探究其在杨树生长及应答盐胁迫过程中的功能。[方法]利用RT-qPCR及转录组测序技术分析‘84K杨’(Populus alba×P.glandulosa)转录因子RAP2L14基因应答盐胁迫表达模式。从‘84K杨’中克隆RAP2L14基因,对RAP2L14基因编码氨基酸序列及上游2000 bp区域启动子结构进行生物信息学分析,构建RAP2L14-RNAi植物表达载体,使用农杆菌叶盘介导法获得转基因84K杨,鉴定表明获得5个RAP2L14-RNAi抑制表达杨树转基因株系。并对盐胁迫条件下转基因株系基础生长指标进行分析。[结果]RAP2L14基因cDNA全长465 bp,共编码154个氨基酸,其表达受盐胁迫诱导。RAP2L14基因上游2000 bp启动子序列含有ABRE、ARE、CGTCA-motif等11个逆境胁迫相关作用元件。盐胁迫后,RAP2L14-RNAi转基因株系的生根率及株高明显低于对照,且生根起始时间推迟了2 d。[结论]杨树ERF转录因子基因RAP2L14为盐胁迫相关基因,其抑制表达提高了转基因株系对于盐胁迫的敏感性,限制了根的发生。本研究为揭示ERF转录因子在杨树分子育种及应答逆境胁迫方面提供候选基因及基础材料。