RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性

大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病害最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式（1~4个）整合至大豆基因组中。对T_1~T_3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T_-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T_2和T_3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显著提高,病情指数降低至4.37~18.51,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显著提高转基因大豆对SMV的抗性水平。

RNAi介导ObR基因沉默对人乳头状甲状腺癌K1细胞增殖与侵袭能力的影响

目的探讨用RNAi介导瘦素受体基因(ObR)沉默人乳头状甲状腺癌K1细胞(K1细胞)增殖与侵袭能力的影响。方法使用siRNA干扰技术瞬时转染构建siRNA-ObR。瞬时转染后,Real-time PCR和Western blotting在mRNA水平和蛋白水平检测siRNA-ObR是否有效抑制K1细胞内靶基因的表达;MTT实验研究ObR沉默后K1细胞的增殖能力;Transwell实验检测ObR沉默后K1细胞的侵袭能力。结果 Realtime PCR实验结果显示,ObR基因沉默后K1细胞ObR mRNA表达显著降低;Western blotting实验结果显示,ObR基因沉默后K1细胞ObR蛋白表达显著降低;MTT实验结果显示ObR对K1细胞的增殖没有意义;Transwell实验结果显示ObR沉默后K1细胞侵袭能力显著下降。结论 ObR基因沉默能有效抑制K1细胞ObR基因的表达,降低K1细胞的侵袭能力。

RNAi-dsRNA介导的基因沉默

RNA干涉(RNA interference,RNAi)是双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)现象,广泛存在于线虫、果蝇、植物、真菌及哺乳动物等多种生物体中。作为生物体中存在的一种普遍现象,RNAi是基因组水平的免疫现象,代表了进化过程中原始的基因组对抗来自外来基因表达的保护机制,它介导生物体对内源寄生性核酸及外源性病原核酸的防御,并调控蛋白编码基因的表达,具有十分诱人的应用前景。本文介绍了RNAi的特征、作用机制、生物学功能及其应用等方面的研究进展。

农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究

将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织。探讨了不同菌浓度、不同侵染时间和不同的共培养时间对玉米转化率的影响,确定了最佳转化条件:菌液浓度OD600值为0.5～0.7,侵染时间为25min,共体培养时间为3d。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,获得了2株阳性植株,初步证明外源基因已经整合到玉米的基因组中。

应用RNAi沉默STAT3基因促裸鼠移植瘤细胞凋亡及对Bax/Bcl-2基因表达的影响

目的应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3(STAT3)基因,探讨其对人乳腺癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡及其对Bax/Bcl2基因表达的影响。方法于雌裸鼠皮下种植MCF7细胞,肿瘤长至一定大小时,随机分为盐水对照(A)组、空质粒对照(B)组及实验(C)组。于肿瘤局部分别注射盐水、psilencer1.0U6空质粒和psilencer1.0U6STAT3siRNA重组质粒。当A组肿瘤长至足够大时处死全部动物,取肿瘤,测其大小及重量,行HE及免疫组化染色,同时用Westernblot检测STAT3,Bax,Bcl2基因的表达水平。结果C组肿瘤瘤块的体积和重量明显小于A,B组(P<0.01)。免疫组化及HE显示C组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死及细胞凋亡征象,STAT3免疫组化呈阴性,而A,B组无此现象。Westernblot显示C组STAT3的表达明显低于A,B组(P<0.01),而Bax的表达明显高于A,B组(P<0.05),各组Bcl2的表达水平差异无显著性(P<0.05)。结论应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤中STAT3的表达,同时引起Bax基因的表达上调,导致细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。

RNA介导的植物基因沉默作用及其应用

基因沉默是生物体基因表达调控的一种重要机制,在各种生物体中普遍存在。基因沉默可以分为转录后基因沉默(post transcriptionalgenesilencing,PTGS)和转录基因沉默(transcriptionalgenesilencing,TGS)。最近的研究发现,在植物中,TGS和PTGS都和RNAi有关。RNA介导的基因沉默为大规模植物生化代谢途径和基因功能的研究提供了一种高通量的反向遗传学手段。简要地介绍了RNAi和RNA介导的DNA甲基化的分子机制,并介绍了RNA介导的基因沉默在植物体中的作用及其在植物基因工程方面的应用。

siRNA介导的survivin基因沉默诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的研究

[目的]研究siRNA(small interferenceRNA)对人膀胱癌BIU-87细胞凋亡和survivin基因表达的影响。[方法]利用Ambion公司设计软件,设计并体外转录合成针对survivin基因的3个特异性siRNA,通过脂质体将siRNA转入BIU-87细胞,分别采用MTT和DNA原位末端标记(TUNEL)法检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率(IR)和凋亡指数(AI),半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和WesternBlotting检测siRNA对survivinmRNA及其蛋白表达的影响。[结果]转染后的siRNA1～3组的BIU-87细胞的IR(41.84%、56.21%、54.13%)和AI(21.98%、36.54%、31.34%)均分别显著高于正常对照组(1.98%和3.17%)(P<0.05),survivinmRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组;其中siRNA2～3对BIU-87细胞的IR、AI和survivin表达的抑制作用均显著高于siRNA1。[结论]体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞survivin的表达,诱导BIU-87细胞凋亡,从而抑制BIU-87细胞生长,为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默提供实验依据。

利用RNAi技术沉默大麦B-Hordein基因的研究

为限制大麦籽粒中贮藏蛋白的积累,降低其蛋白质含量,以大麦幼胚为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将大麦B组醇溶蛋白基因gp4/antisense gp4片段与Ubi启动子相连导入大麦,经PCR检测证实,含有gp4反向重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入大麦。RT-PCR结果表明,转基因株系中B-Hordein mRNA积累受到明显抑制。收获T1代籽粒,经近红外谷物分析仪测定表明,2个转基因大麦株系籽粒蛋白质含量(分别为11.4%、11.7%)较对照(12.3%)降低。因此,利用RNA干涉技术降低大麦蛋白质含量是可行的。

RNA介导的转录后基因沉默

RNA介导的转录后基因沉默 (post transcriptionalgenesilencing ,PTGS)指一种普遍存在于生物界的 ,由双链RNA (doublestrandedRNA ,dsRNA)引起同源mRNA降解进而导致基因不表达的的生物学现象。其最重要的特点是只会特异性抑制同源性mRNA的表达 ,而不影响其他基因的表达 ,并能稳定地遗传到后代中。RNA介导的PTGS具有多种生物学功能 ,如抵御外来遗传物质的侵犯和病毒的侵染 ,控制生物体的生长发育等。RNA介导的PTGS将是目前分子生物学领域的研究热点之一 ,并在研究基因功能、基因治疗、抗病毒基因工程、剖析和调控次生代谢途径等方面有着广阔的应用前景。本文对RNA介导的PTGS的历史、机制、特点、相关酶类、生物学功能及应用作了比较详尽的综述。

RNAi导致基因沉默的机制和应用进展

RNAi主要通过双链RNA(dsRNA)被核酸酶切割成21～23nt的干涉性小的RNA,即siRNA,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现的;RNAi需要多种蛋白质因子以及ATP参与,而且具有生物催化反应特征;RNAi具有高效性和高度特异性,作为一种关闭特定基因的新技术,为基因功能研究提供了一个快速、简便的方法,在后基因组时代应用前景广阔。

农杆菌介导的ACO基因RNAi载体转化百合抗衰老研究

本研究旨在通过根癌农杆菌介导法将ACO基因转入亚洲百合植株中,为植物抗衰老提供理论依据和技术基础。以亚洲百合‘精粹’无菌苗离体小鳞片为外植体,利用农杆菌介导法将携带有抗衰老基因ACO的RNAi载体转化到百合中,观测分析影响百合遗传转化的因素。结果表明:在遗传转化过程中,预培养3 d后,在菌液和共培养基中均添加25 mg/L乙酰丁香酮,将OD600=0.8的根癌农杆菌侵染小鳞片8 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率,抗性植株经PCR检测部分呈现阳性,初步证明ACO基因已经导入到百合基因组中。

RNAi技术——一项使特异基因表达沉默的新技术

RNAi技术是新近发展起来的一种使特异基因表达沉默的方法 ,这项技术还处于起步阶段。本文对RNAi技术的概念、作用机制和应用前景等方面作了介绍。

RNAi基因沉默技术及其在植物抗病性改良中应用的策略

RNAi(RNA interference)是一种由dsRNA参与、对靶基因表达进行干扰或沉默的现象。由此发展起来的RNAi基因沉默技术已成为当今植物基因功能研究和遗传改良的一个重要手段。该技术已经在靶向病原物(真菌、细菌、病毒和线虫)基因沉默方面得到了广泛的应用,并且产生了一批抗病性增强的转基因植物。人工设计和合成的amiRNAs和ata-siRNAs的成功研发加快了RNAi技术的应用。本文对RNAi基因沉默机制、RNAi技术研发进展及其在植物抗病性遗传改良中的应用进行综述,并对其应用策略进行探讨。

超声微泡介导Itch基因沉默增强T细胞对肺腺癌细胞LA795免疫杀伤作用

目的利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率。方法磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,Western blot检测Itch蛋白表达。转染72 h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795共培养时肿瘤杀伤率。结果利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3%±3.8%,Itch蛋白表达能够有效被抑制。转染72 h后,超声微泡介导沉默Itch基因显著增加T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平(P<0.05);与空白组或阴性对照组T细胞相比,在不同的靶效比水平(10∶1、20∶1、40∶1),转染T细胞杀瘤活性均明显增高(P<0.05)。结论利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Itch基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率。

植物介导的RNA干扰引起马铃薯晚疫病菌基因的沉默

由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是最具毁灭性的马铃薯病害。为明确植物介导的RNAi沉默致病疫霉基因的有效性,本研究采用重叠延伸PCR技术克隆同时与晚疫病菌4个ces基因均同源的融合基因C1234,构建内含子连接的C1234反向重复序列植物表达载体,采用农杆菌介导法转化晚疫病易感马铃薯品种大西洋,经PCR和Southern杂交检测,获得129个转基因株系。离体叶片接种病原菌后,有97个转基因株系发病速度明显慢于野生型,接种6 d后病斑大小和霉层厚度均明显小于对照,并且叶片感病部位没有出现失绿斑,而野生型产生了明显的失绿斑。实时定量RT-PCR分析发现,发病延缓的叶片上致病疫霉4个纤维素合酶基因的表达水平明显低于野生型。本研究表明,转基因植株中产生的以晚疫病菌ces基因为靶标的ds RNA能够沉默致病疫霉相应基因表达,延缓发病进程。

RNA介导的转基因沉默:原理及应用

RNA介导的转基因沉默是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。本文对植物中RNA介导的转基因沉默的机理做了详细的阐述,并且将各种生物中在此过程中起关键作用的蛋白及其功能进行了总结,最后介绍dsRNA作为一种基因组学研究手段的优势和它实际的应用前景。

利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因

为了鉴定可能的小麦抗光氧化基因,利用大麦条斑病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)系统,对6个小偃54响应强光的基因进行了沉默表达研究。以BSMV:GFP植株为对照,分析了这些基因的减量表达植株在低温强光、DCMU、MV、H2O2等处理下的PSII最大光化学效率(F v/F m)和光合性能指数(P.I.)、MDA含量及整株生物量变化。结果显示,Ta23008和Ta92165均参与小麦对低温强光、DCMU、MV和H2O2等胁迫的响应过程;Ta106078参与小麦对DCMU、MV和H2O2等胁迫的响应过程;Ta27787参与小麦对低温强光、DCMU和H2O2等胁迫的响应过程;Ta24695参与小麦对低温强光和H2O2胁迫的响应过程;而Ta119251仅参与小麦对DCMU的响应过程。此外,Ta23008、Ta92165、Ta106078、Ta119251四个基因被抑制表达后,其转化株系的生物量比对照显著降低,推测其可能参与调控小麦生物量的积累。

应用载体介导的RNAi技术抑制HCMV的UL49基因表达

为了研究RNA干涉抑制HCMV UL49基因的作用,以pLXSN(U6启动子)为模板通过两步PCR的方法扩增含U6启动子的siRNA表达片段,并通过TA克隆将siRNA表达片段克隆到pMD18-T载体构建成siRNA表达质粒,同时以人巨细胞病毒AD169病毒株基因组为模板PCR扩增UL49基因,将其克隆到pEGFP-N1构建融合质粒pEGFP-UL49。通过脂质体介导将siRNA表达质粒和pEGFP-UL49质粒共转染人宫颈癌细胞系HeLa,在荧光显微镜下观察RNA干涉结果。通过这种方法得到具有介导RNA干涉的siRNA片段,为UL49基因沉默研究提供技术基础。

双链RNA介导的转录后基因沉默及其在血液系统肿瘤中的应用

双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)普遍存在于生物界中。PTGS是通过向细胞内引入核酸为起始,激发dsRNA的产生、小干扰(siRNA)的形成和mRNA特异性降解,从而阻断蛋白质的翻译而引起的基因沉默。它具有特异、高效等特点。研究表明,PTGS与细胞的生长发育、维持遗传稳定性和抵抗外来核酸的入侵有关,故用于血液系统肿瘤病因、发生发展和治疗的研究具有重要的价值。

利用花粉介导法获得油菜RNAi转基因植株

以甘蓝型油菜7B为试验材料,利用花粉介导法将携带RNA干扰的HKL1基因的pCaMHKL1-RNAi质粒转入7B中,获得转基因油菜植株,通过PCR分别对T_1,T_2植株进行了转基因鉴定,并对转基因植株后代的生长发育进行研究。结果表明,T_2的RNAi植株与野生型植株相比,出真叶时间较晚,株型较矮小;qRT-PCR结果表明,RNAi植株中HKL1基因的相对表达量为野生型植株的24.6%~67.9%;不同的RNAi植株中HKL1基因的表达量各不相同;利用花粉介导法在甘蓝型油菜中进行RNAi质粒转化,外源基因可以在后代植株中稳定遗传。花粉介导法较之农杆菌侵染、基因枪法等基因转化方法操作更加简单、适用性更强。