p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建

目的:设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列,并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒。方法:以小鼠SSTR5基因为靶序列,用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA,退火形成双链DNA后,与经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR-Pμzro/GFP连接,产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:构建的重组表达质粒PCR产物为161bp,其中插入的SSTR5-siRNA片段为61bp,测序结果与参考序列完全一致。结论:成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒。

慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建携带人白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP,并检测其在NIH3T3细胞中的表达。方法:采用PCR技术从含有人IL-1ra基因的质粒pEGFP-N1-IL-1ra中扩增目的基因IL-1ra,并将该基因克隆至慢病毒表达质粒pLenti,PCR及DNA测序来鉴定构建的重组质粒pLenti-IL-1ra。从质粒PMIG中切取IRES-GFP基因片段,插入鉴定正确的质粒pLenti-IL-1ra中以构建重组质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP。将构建成功的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP、包装质粒Δ8.91、包膜质粒pVSVG共转染293T细胞。获取携带IL-1ra基因的重组慢病毒Lenti-IL-1ra-IRES-GFP,并感染NIH3T3细胞,荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达。灭瘟素(Blasticidin)筛选15 d,RT-PCR检测目的基因的表达,ELISA检测目的蛋白的表达。结果:PCR及DNA测序结果均表明人IL-1ra基因与质粒pLenti正确重组;IRES-GFP基因经PCR鉴定已成功插入质粒pLenti-IL-1ra;三质粒共转染293T细胞可获得重组慢病毒。慢病毒感染NIH3T3细胞后,荧光倒置显微镜下能直接观察荧光蛋白的表达,RT-PCR和ELISA分别检测到IL-1ra在基因水平和蛋白水平的表达。结论:成功构建了携带人IL-1ra基因的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的进一步研究奠定了实验基础。

第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探

目的:对目前最为常用的三质粒慢病毒包装系统进行优化,以期明确各质粒表达的病毒成分对提高慢病毒包装效率的重要性。方法:在限定总质粒量为10μg的情况下,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的目的质粒、表达gag/pol、Rev、VSVG的包装质粒按不同比例混合,转染293T细胞进行病毒包装,48 h后收集上清用于感染293T及K562细胞,72 h后经流式细胞术检测GFP+阳性细胞比例,分析所获病毒的感染效率。结果:采用不同的质粒混合比例包装的病毒感染效率具有明显差异,其中携带GFP的目的质粒量影响作用最为显著,当目的质粒量从15%(1.5μg)增至35%(3.5μg)时,GFP+293T细胞比例从14.2%升至45.1%,增加了3.2倍。当固定目的质粒量为35%,同时分别将表达gag/pol或Rev的质粒量从15%提高到25%时,改变Rev组的GFP+阳性率提升最明显,为1.5倍;而改变VSVG质粒量在已测试的混合比例中作用不显著。包装病毒感染K562细胞的结果与293T细胞类似。结论:通过对比包装病毒的感染效率,优化了慢病毒包装的混合质粒条件,并成功地应用于感染白血病细胞系;首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高病毒的包装效率,为利用慢病毒表达体系研究多种基因在血液系统中的功能奠定了技术基础。

基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建

目的构建基因组不稳定细胞CDT1基因过表达和RNAi模型,为进一步探讨该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法根据CDT1基因信息,以慢病毒载体GV218设计合成两种重组质粒,分别包含CDT1基因全长序列以及阴性对照序列;以慢病毒载体GV248设计合成两种重组质粒,分别包含CDT1基因的小干扰序列以及用于干扰对照的阴性序列。利用Western blot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测。通过转染293T细胞进行慢病毒的包装。利用ELISA和荧光法分别进行滴度的检测。再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL-7702肝细胞,利用qPCR检测CDT1表达量。结果测序结果表明重组质粒构建成功,并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为4.3×108TU/ml;RNAi病毒滴度为2.0×108TU/ml。过表达慢病毒能有效上调CDT1的表达,过表达效率为65%。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制CDT1的表达,抑制效率为88%。结论成功构建基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi模型,为进一步研究CDT1在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。

表达hCD4和hCCR5基因的慢病毒载体的构建

目的:构建一种高效转染h CD4和h CCR5基因的慢病毒载体。方法:应用Gateway技术构建可表达h CD4和h CCR5的质粒载体PLA.Ex Bi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5,并进行酶切和测序鉴定,进行慢病毒包装,用q RT-PCR方法检测293T细胞中h CD4/CCR5的m RNA表达。将本慢病毒载体转染于小鼠白血病细胞L615,应用q RT-PCR检测细胞内h CD4/CCR5 m RNA的表达及对HIV-1的易感性。结果:成功构建PLA.Ex Bi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5质粒表达载体,包装成的慢病毒载体在293T细胞中具有h CD4/CCR5 m RNA水平的高表达(P<0.05);转染于L615细胞亦表现出h CD4/CCR5 m RNA水平的高表达(P<0.05),并具备了HIV-1入胞感染的特点。结论:成功建立h CD4和h CCR5基因双启动的慢病毒载体,可使目的细胞高效表达h CD4及h CCR5分子,对HIV-1宿主细胞的制备、HIV/AIDS的发病机制和抗病毒研究具有积极的意义。

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。

鸡斑联蛋白基因的慢病毒干扰载体的构建及筛选

本试验旨在构建4条鸡斑联蛋白(zyxin)基因的RNAi慢病毒载体,对其进行滴度测定,并进行有效干扰靶点的筛选,为以后开展鸡zyxin基因抗球虫机理的研究奠定基础。提取鸡胸腺组织的RNA,反转录,扩增zyxin基因的编码区,并将其克隆到真核表达载体Pex-6上。设计针对zyxin的shRNA序列,应用基因重组技术插入到Lv3慢病毒表达载体中,将lv3-shRNA载体与包装质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-G共转染293T细胞,进行病毒包装。将得到的病毒原液10倍稀释6个梯度,分别转染293T细胞,进行滴度的测定。将构建好的4条慢病毒载体与Pex-6-zyxin真核表达载体共转染293T细胞,运用RT-PCR和Western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选。构建4条针对目的基因zyxin的RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体CO1、CO2、CO3、CO4和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×108 TU·mL-1,适合感染目的细胞,经过筛选,CO3对zyxin在293T细胞中的表达干扰效果最佳。成功构建了zyxin基因RNA干扰慢病毒表达载体,并进行了有效干扰靶点的筛选,为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础。

基于慢病毒系统构建AMPKα1过表达的3T3-L1细胞系

[目的]采用慢病毒系统构建AMP依赖的蛋白激酶α1(AMP activated protein kinase α1,AMPKα1)基因过表达的3T3-L1细胞系,探讨其对炎症因子表达水平的影响。[方法]在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上查找到AMPKα1的基因序列,利用SnapGene软件设计引物,进行目的基因扩增、纯化。将纯化后的AMPKα1片段克隆到PLJM1-EGFP载体质粒上,构建好的质粒与辅助质粒共同转染到HEK293T细胞中,收集病毒液。用含有病毒液的培养基培养3T3-L1细胞,待抗性蛋白表达后用嘌呤霉素筛选,杀死未成功转染的3T3-L1细胞,更换新鲜的完全培养基继续培养。[结果]成功构建稳定过表达AMPKα1的3T3-L1细胞系(P<0.05);AMPKα1过表达的3T3-L1细胞系的炎症因子MCP-1蛋白表达水平降低(P<0.05),炎症减轻。[结论]过表达3T3-L1细胞中的AMPKα1,减轻炎症因子MCP-1的表达水平(P<0.05)。

脂质体和慢病毒介导P75神经生长因子受体及神经生长因子转染骨髓间充质干细胞的效果比较

背景:P75神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75^(NTR))在不同细胞中可以介导截然不同的信号通路,但是在骨髓间充质干细胞中所传导的调节作用还尚未研究;脂质体和慢病毒介导单基因转染细胞技术已趋向成熟,但是其介导双基因转染的差异比较还未见报道。目的:构建大鼠P75^(NTR)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的过表达质粒及慢病毒载体,比较脂质体和慢病毒介导2种基因转染骨髓间充质干细胞的效果和实用性,以便于今后根据不同实验要求选择实验最优方案。方法:设计大鼠P75^(NTR)及NGF的基因引物,提取基因组DNA进行PCR扩增、与质粒载体重组构建表达增强绿色荧光的GV358-P75^(NTR)、表达增强红色荧光的GV492-NGF过表达质粒,转染293T细胞,加入慢病毒载体超速离心,收集目的基因过表达慢病毒,测定病毒样品滴度;选取体外培养的大鼠原代骨髓间充质干细胞,一组用脂质体Lipo3000共转染质粒GV358-P75^(NTR)、GV492-NGF,另一组用慢病毒共感染,同时设置阴性对照组和空白对照组,对转染后的骨髓间充质干细胞常规培养,第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达,Westernblot检测P75^(NTR)及NGF蛋白表达,对转染后培养至7d的骨髓间充质干细胞进行消化传代培养,培养第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达以及Western blot检测P75^(NTR)、NGF蛋白的表达。结果与结论:①构建的GV358-P75^(NTR)、GV492-NGF过表达质粒及慢病毒符合实验设计;②显微镜视野中红绿色荧光的丰度:脂质体共转染组先增加后降低,慢病毒共感染组持续增多;各时间点慢病毒组均多于脂质体组;脂质体转染组传代培养细胞的荧光表达相比于未传代前降低,而慢病毒转染组未见明显变化;③各时间点慢病毒感染组的P75^(NTR)及NGF蛋白表达量明显高于脂质体组,目的基因转染组的P75^(NTR)及NGF蛋白表达量均高于阴性对照组及空白对照组,差异有显著性意义(P<0.05);④P75^(NTR)、NGF双基因均能通过脂质体和慢病毒共转染方法在大鼠骨髓间充质干细胞中过表达;脂质体双基因转染操作相对简便,实验设备依赖性低,费用相对低廉,但感染效率明显低于慢病毒,而慢病毒双基因共感染后目的基因存在着持续表达,传代后基因丢失现象不明显。

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经Bam HⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA(siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应(real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA(mRNA)和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明,DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。

APPswe基因慢病毒表达质粒的构建及对其SH-SY5Y细胞生长和凋亡的影响

为考察APPswe基因的表达对细胞生长和凋亡作用的影响,本研究采用gateway分子重组技术构建表达APPswe基因的慢病毒质粒,并将该质粒转染至SH-SY5Y细胞中。用RT-PCR和Western blot技术分别测定APPswe基因的mRNA转录和蛋白翻译水平。活细胞计数法和细胞外乳酸脱氢酶法分别测定细胞存活力和细胞膜损伤程度。Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定细胞凋亡水平,Hoescht 33342染色观察细胞核形态变化,DCFH-DA染色法测定胞内活性氧水平。转录和翻译水平的验证表明,APPswe基因能够在SH-SY5Y细胞中相对稳定地表达。表达APPswe基因后,细胞的存活能力降低,损伤程度增加,细胞内活性氧水平上升,细胞核浓缩聚集,细胞发生凋亡反应。试验结果表明,APPswe基因的表达对SH-SY5Y细胞生长产生抑制作用,造成细胞损伤和凋亡,表达APPswe基因的SH-SY5Y细胞系可应用于体外AD病理发生机制和药物作用的研究。

新型丙型病毒肝炎病毒core及NS3抗原的研发及制备

目的建立大规模生产与纯化工艺,为献血者HCV感染筛查或临床诊断提供新一代免疫测定新型抗原。方法利用聚合酶链反应(PCR)从我国HCV流行株(基因型1b)中分离core与NS3全长基因。采用重组慢病毒包装系统,构建分别表达HCV core与NS3的表达质粒与重组病毒。利用重组慢病毒感染293A或Huh7细胞,采用免疫荧光染色、West Blot和ELISA方法测定细胞表达的core或NS3蛋白抗原特性。结果构建了pTY-CMV-core和pTY-CMV-NS3慢病毒表达质粒,包装出了高病毒滴度的重组慢病毒。质粒转染293T细胞后,免疫荧光能检呈强阳性,Western Blot分析可见预期大小分子量的表达蛋白。

shRNA慢病毒质粒的构建技巧

携带shRNA慢病毒质粒的慢病毒宿主范围广,能感染分裂期与非分裂期细胞,转染效率高,shRNA在宿主细胞中能高效、长期稳定地表达,因此shRNA慢病毒载体正被越来越广泛地应用于RNAi研究和疾病治疗中。

HBV prec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建和鉴定

目的构建针对HBV prec/c区的shRNA真核表达载体psiHBV,感染HepG2 2.15细胞后观察其对HBeAg表达的抑制作用,为探讨防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助系统质粒共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,RT-PCR检测prec/c mRNA的转录,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建针对HBVprec/c的慢病毒载体psiHBV1、siHBV2,慢病毒介导的RNA i能抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术治疗乙型肝炎提供了实验依据。

慢病毒介导的RNAi下调miR-221抑制U87胶质瘤细胞生长的研究

目的探讨下调miR-221对U87胶质瘤细胞生长的影响及可能的作用机制。方法构建靶向miR-221的siRNA慢病毒表达载体并感染U87胶质瘤细胞，应用原位杂交、定量PCR和Westernblot法检测干扰后细胞内miR-221及p27蛋白表达变化，M1Tr法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化，Transwell法检测细胞侵袭力改变。结果成功构建了靶向miR-221的siRNA慢病毒表达载体，该载体能有效抑制内源性miR-221的表达，同时上调p27蛋白的表达，同时抑制细胞生长，诱导凋亡，降低细胞的侵袭力。结论成功构建靶向miR-221的RNAi慢病毒表达载体，该载体能够有效抑制miR-221的表达并抑制U87胶质瘤细胞的生长，为以miR-221为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础。

慢病毒介导的miR194-5p过表达精原细胞株的建立

目的构建miR194-5p慢病毒表达载体pMSCV-PIG-miR194-5p,应用包装后产生的慢病毒感染Stra8-GC1-spg细胞,获得稳定过表达miR194-5p精原细胞株。方法用PCR法扩增miR194-5p的前体序列pri-miR194-5p。利用分子克隆技术构建慢病毒表达载体pMSCV-PIG-miR194-5p。将其与Gag pol和VSV.G辅助质粒一起用PEI法共转染至293T包装细胞内,收集慢病毒上清,后将其感染Stra8-GC1-spg细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达miR194-5p的精原细胞株。结果构建了慢病毒重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p。经酶切鉴定及DNA测序法证实序列准确无误。经包装产生的慢病毒能成功感染Stra8-GC1-spg细胞,并稳定过表达miR194-5p。结论成功地构建了慢病毒表达重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p,经包装后产生预计的慢病毒,建立了稳定过表达miR194-5p的精原细胞株。

mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响。方法重组SiRNA表达质粒LV-mCD99L2,体外转染内源性mCD99L2表达阳性的A20细胞,筛选出稳定表达LV质粒的细胞株并扩增培养;采用免疫荧光技术和流式细胞仪检测转化前后两组细胞鼠源CD30表达;透射电镜观察转化后细胞超微结构的形态特点;细胞计数方法动态观测培养细胞干扰组A20-LV-mCD99L2和未经干扰组A20细胞的H/RS样细胞(直径≥25μm)转型率,以人霍奇金淋巴瘤细胞系L428作为对照;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果获得了稳定表达LV质粒的单克隆细胞株A20-LV-mCD99L2;免疫荧光标记显示转化细胞CD30(+);流式细胞仪检测A20-LV-mCD99L2细胞CD30阳性率为54.4%;透射电镜观察转化后细胞核增大,可见单核、双核及多核,核仁明显的H/RS样细胞;干扰组H/RS样细胞的转型率明显高于未经干扰组(P<0.01)。两组处于S期的细胞无明显差异,两组细胞均未见凋亡峰。结论mCD99L2基因沉默可诱导小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞。

let-7a慢病毒对人胃癌细胞影响的体外实验研究

lethal-7（1et-7）是1993年后被发现的第二个微小RNA（microRNA，miRNA）[1]，我们从正常组织中克隆let-7a全长基因，并将其连接到了慢病毒载体，利用重组慢病毒将let-7a转导人胃癌SGC-7901细胞，研究转基因前后SGC-7901细胞生物学特性的变化。1 材料与方法 1．1材料人胚胎肾上皮细胞293T、人胃癌细胞系SGC-7901均购自中国科学院上海细胞库。质粒Pwpxl—MOD2、pRsv—REV、pMDlg—pRRE、pMD2G购自美国Invitrogen公司；Iet-7a表达质粒Pwpxl—MOD2-let-7a由本实验室构建。let-7a特异性寡核苷酸引物由美国Invitrogen公司设计合成。