象草4CL基因片段的克隆及RNAi表达载体构建

象草是热带和亚热带地区广泛栽培的多年生资源植物。为探讨华南象草4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)基因下调表达对木质素合成的影响,本研究设计1对特异引物,PCR扩增获得一段长为374bp的干扰片段。通过TO-PO克隆,将该片段克隆到载体pCR/GW/TOPO,构建了入门克隆载体pENTR-4CL;再经过LR反应使pE-NTR-4CL上的干扰片段进入目的载体pCB2004B上,形成表达载体pCB2004B-4CL,最后通过冻融法将其转入到根癌农杆菌EHA105中。菌液PCR结果表明RNAi质粒已成功转入农杆菌,为进一步利用RNAi技术研究4CL基因的功能奠定了基础。

桃蚜MpAChE基因RNAi表达载体构建及转化

通过害虫取食植物表达害虫发育关键基因dsRNA的转基因植株,分析能否通过抑制害虫特定基因的表达来防控害虫。本研究利用RT-PCR技术从桃蚜中克隆乙酰胆碱酯酶基因383 bp cDNA片段,命名为MpAChE。进一步利用该MpAChE基因片段构建植物RNAi表达载体RNAi-MpAChE,并通过浸花法转化野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性筛选转化植株,PCR及Southern杂交进一步鉴定转基因植株。结果表明:克隆的cDNA片段与桃蚜中已克隆的乙酰胆碱酯酶(GenBank登录号AY147797)cDNA序列核苷酸一致性为99%。卡那霉素抗性初步筛选和PCR进一步鉴定,获得25株阳性转基因植株。从25株中随机选择的5株阳性植株,Southern杂交均为阳性。经接种桃蚜初步鉴定,转基因植株对蚜虫的抗性效果不显著。

苹果抗病毒RNAi表达载体构建及转化烟草研究

病毒病严重影响中国苹果生产。为创制抗病毒植物新材料,本研究采用Gateway技术构建了含3种苹果潜隐性病毒CP基因片段的RNAi植物表达载体,并对烟草进行了遗传转化。采用RT-PCR分别克隆获得了苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒的CP基因保守区段,用重叠延伸PCR方法串联获得了902 bp的大片段ALV用作干扰片段。先通过TOPO克隆将该片段克隆入载体pENTR/SD/D,构建了入门载体pENTR-ALV,再经LR反应使干扰片段ALV替换目标载体pHELLSGATE12上的ccdB基因,形成了同时含3种病毒CP基因片段的RNAi表达载体PH12-ALV。用冻融法将其转入根癌农杆菌菌株EHA105,并用叶盘法遗传转化烟草品种本氏烟,经PCR鉴定,结果表明目的基因片段已成功转入烟草中。

亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。

不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因(GLDH)cDNA片段克隆与RNAi表达载体构建

根据植物中hpRNA(hairpin RNA)原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计1对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过3次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定已插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,为深入研究GLDH基因功能提供有效的工具。

水稻隐花色素基因Cry1a/Cry2/Cry1b RNAi表达载体构建及遗传转化研究

构建一个包含3个水稻隐花色素基因片段的RNAi表达载体pSC1301-347-Cry1aCry2Cry1b并转化水稻,以期导致Cry1a、Cry1b与Cry2集体沉默,观察它们对水稻重要农艺性状的影响。结果表明,转基因水稻开花期显著延迟,结实率骤降,株高增加,剑叶变短,谷粒变长、变宽;而剑叶宽、穗长与对照无显著差异。

木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建

MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。

甜菜BvPCNA基因RNAi载体构建

【目的】增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在植物中广泛存在,但是其在植物中的功能研究较少。本研究可以为BvPCNA-like基因的功能分析奠定基础。【方法】课题组前期在甜菜基因组中克隆获得一个基因位点,命名为BvPCNA-like基因,本研究以BvPCNA-like基因的克隆载体为初始材料,选取适宜的靶序列,利用植物表达载体pFGC5941作为基础载体,使靶序列上游启动子为35 S,植物筛选标记为抗除草剂基因BlpR,设计靶序列特异性引物,采取PCR-酶切-连接方法,构建BvPCNA-RNAi载体。【结果】通过RCR鉴定表明已获得了预期目标载体,插入片段由正向靶序列BvPCNA-F、中间片段、反向靶序列BvPCNA-R组成,靶序列长度为320 bp。【结论】本研究所得载体适用于对双子叶植物进行遗传转化,可以作为BvPCNA-like基因理论研究或应用研究的载体材料。

枣ZjPG基因表达分析及载体构建

【目的】克隆枣多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因,分析ZjPG基因表达模式并构建过表达载体,为探究ZjPG基因调控枣裂果的分子机制及培育抗裂枣品种提供理论参考。【方法】以壶瓶枣为试验材料,克隆ZjPG基因(ID:LOC107426373),采用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL等在线工具对ZjPG蛋白进行生物信息学分析;利用MEGA 7.0构建基于PG氨基酸序列的系统发育进化树并分析ZjPG基因启动子顺式作用元件;通过荧光定量PCR检测枣不同组织(幼叶、成熟叶、花、幼果和膨大期、白熟期、脆熟期及完熟期果实)与不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA,0.2和0.4 mol/L)和脱落酸(ABA,0.2 mol/L)处理下枣果实及脆熟期正常果实和开裂果实中ZjPG基因的相对表达量,并构建ZjPG基因过表达载体。【结果】壶瓶枣中ZjPG基因的编码区(CDS)序列全长为1353 bp,与NCBI网站ZjPG基因CDS序列相似性为99.70%,氨基酸序列相似性为99.33%,说明成功克隆ZjPG基因。ZjPG蛋白分子量为49145.28 Da,编码450个氨基酸残基,理论等电点为6.27,无跨膜结构域,为稳定亲水性蛋白,含有Pgu1保守序列。其二级结构由12.67%的α-螺旋,32.22%的延伸链,8.00%的β-折叠及47.11%的无规则卷曲组成。系统发育进化树结果显示,ZjPG与拟南芥AtPG和葡萄VvPG的亲缘关系较近,ZjPG与其他9个物种的PG蛋白基序具有高保守性。ZjPG基因的启动子中包含多个激素响应顺式作用元件。实时荧光定量PCR检测结果显示,ABA和MeJA均可诱导ZjPG基因表达;裂果中ZjPG基因相对表达量显著高于正常果(P<0.05);ZjPG基因在壶瓶枣的叶、花和果实中均有表达,在完熟期果实中的相对表达量最高。成功构建pCAMBIA-1300-ZjPG表达载体。【结论】成功克隆壶瓶枣ZjPG基因CDS序列并成功构建该基因的过表达载体,不同物种之间的PG蛋白序列具有高度保守性,ZjPG基因的表达受到ABA和MeJA信号调控,在裂果中高表达,ZjPG基因表达具有组织特异性和时空特异性。

鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达载体构建

【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体,原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

小鼠SGK3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3(serum and glucocorticoid-induced protein kinase 3,SGK3)基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry,并观察和验证其在转染细胞HEK293中的表达。方法通过聚合酶链式反应将实验室保存的真核表达质粒pcDNA3.1-MYC-SGK3中目的基因SGK3与mCherry融合并扩增出来,然后定向克隆至pcDNA3.1-MYC质粒中,经限制性内切酶消化和测序证实后,通过脂质体法转染HEK293细胞,Western blotting法检测目的基因的蛋白表达情况。结果测序结果与之前预期结果相符,证实pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry真核表达载体构建成功。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry的HEK293细胞出现清晰的阳性反应条带,说明目的片段成功表达。结论pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry真核表达载体构建成功。

TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的构建转录因子增强子结合蛋白-2α的真核表达载体并进行鉴定,为TFAP2A的后续研究提供有效工具。方法采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对真核表达载体CV702质粒进行酶切获得线性化载体;通过PCR扩增制备TFAP2A的cDNA片段,将线性化载体和TFAP2A的cDNA扩增产物进行体外环化连接,构建CV702-TFAP2A重组质粒。将连接产物进行细菌转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。将CV702-TFAP2A重组真核表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot检测TFAP2A的表达效率。结果菌落PCR扩增和测序结果显示,CV702-TFAP2A重组真核表达载体构建成功;Western blot结果与Image J灰度值分析结果显示,与CV702对照载体相比,转染CV702-TFAP2A重组质粒的MDA-MB-231中的Flag-TFAP2A蛋白相对表达量更高(P<0.05)。结论成功构建CV702-TFAP2A的重组真核表达载体,证实转染CV702-TFAP2A的细胞中Flag-TFAP2A的表达水平升高。

猪流行性腹泻病毒E基因原核表达载体的构建

目的:通过构建猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)E基因原核表达载体pET-E,为后续探讨E基因的原核表达以及功能研究奠定基础。方法:将PEDV E基因通过PCR方法进行扩增,PCR产物经凝胶电泳检测后,用试剂盒纯化回收目的片段,将胶回收产物与表达载体pET-32a连接后,转化入Trans BL21(DE3)感受态细胞中,挑取单菌落,摇菌培养过夜,提取质粒,用双酶切鉴定阳性载体。结果:成功扩增大小为231 bp的目的片段,构建了PEDV E基因原核表达载体。结论:本研究成功构建了PEDV E基因原核表达载体,为下一步进行E基因原核表达以及进一步研究PEDV E基因的功能奠定基础。

硒诱导的黄瓜耐镉转录本鉴定分析及表达载体构建

以黄瓜乙烯响应因子CsERF7转录本为研究对象,通过外源硒缓解黄瓜镉胁迫试验分析其表达及黄瓜生长状况,并克隆CsERF7基因,构建过表达载体转化拟南芥,同时分析CsERF7的理化性质和功能。结果表明,外源硒显著升高了镉胁迫引起的黄瓜生长指标的降低,CsERF7在镉处理下的表达丰度是对照的56%,而镉+硒比单独镉处理上调表达4.53倍,与RNA-seq结果相符,此基因可能在硒调控黄瓜镉胁迫响应中起作用。同时,成功构建超表达载体pEGOEP35S-H-ERF7-GFP,转化拟南芥获得转基因株系。生物信息学分析表明,黄瓜CsERF7基因属于AP2/ERF家族的AP2亚家族,开放阅读框ORF长度588bp,编码196个氨基酸,有1个AP2结构域;该蛋白属于非跨膜亲水性蛋白,亚细胞定位预测定位在线粒体中,存在22个氨基酸磷酸化位点;其二级结构主要由α-螺旋和延伸链构成,与三级结构预测结果高度一致,所得蛋白序列与黄瓜、甜瓜同源性最高。

大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi双元表达载体的构建及其转基因

植物类受体蛋白激酶(plant receptor-like kinases RLKs)以其特有的结构在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要的作用。利用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)来研究RLKs的功能已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理,以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基因,在rlpk2-cDNA序列3'端选择312bp作为构建RNAi的序列,借助中间克隆载体,经过三次亚克隆,最后形成含rlpk2-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-R2,并转入农杆菌LBA4404。采用农杆菌介导大豆子叶节转化方法,共获得了三株转基因植株。转基因植株 RT-PCR分析表明rlpk2基因已被成功敲减(knock-down),并且发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因表达明显改善大豆叶片的光合能力,结合前期研究结果,表明rlpk2基因可能在维持叶绿体的结构及保护叶绿体膜系统的完整性方面起负调节作用。

玉米淀粉分支酶基因的克隆与RNAi表达载体的构建

利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定玉米淀粉分支酶SBEⅡb的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从玉米自交系‘综31’中分别成功克隆出了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因的部分序列及其启动子序列,从大肠杆菌中成功克隆了木糖异构酶基因xylA作为筛选标记,构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅡb启动子驱动的含有sbeⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC413,并对玉米自交系实施转化。经PCR检测转基因玉米再生植株,初步判定目的序列已经成功整合到玉米再生植株的基因组中。

蓖麻细胞色素P450基因片段的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法克隆了蓖麻细胞色素P450基因的正反2个片段。正向片段长为525个碱基,反向片段长为421个碱基。经测序分析,得到的正向基因片段和反向基因片段与GenBank上的蓖麻细胞色素P450基因(XM_002525863.1)的碱基同源性分别为98.85%和99.51%。利用载体pHANNIBAL和限制性内切酶将正反2个片段连接成具有发夹结构的中间载体pHAN-P450S-P450A,然后将中间载体和表达载体pBI-121连接,构建了P450基因的RNAi植物表达载体,为利用RNA干扰抑制P450基因表达的研究奠定了基础。

人细胞周期蛋白cyclin D_1基因RNAi表达载体的构建与鉴定

[目的]构建针对人细胞周期蛋白cyclinD1基因的RNAi真核表达载体,检测其对人卵巢癌HO-8910细胞cyclinD1基因表达的干扰效率。[方法]以cyclinD1为靶向设计,合成的4条互补寡核苷酸链克隆至pSUPER载体中,得到重组质粒pSUPER-C1￣4,行双酶切分析后测序鉴定;运用脂质体介导转染HO-8910细胞,G418筛选;采用RT-PCR检测对cyclinD1基因mRNA表达的干扰,并筛选有效的siRNA干扰序列。[结果]经酶切测序鉴定证实,重组质粒中已插入目的序列;RT-PCR表明有4个重组载体均不同程度抑制目的基因的转录,但以pSUPER-C2的干扰效率最强。[结论]在卵巢癌细胞系筛选出有效干扰cyclinD1基因表达siRNA序列,成功构建针对cyclinD1基因的RNAi真核表达载体有效抑制目的基因的表达。

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。