c-FLIP(L)基因的RNAi靶向沉默干扰大肠癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨RNAi靶向沉默c-FLIP(L)基因对大肠癌细胞株SW480凋亡的影响。方法将实验对象分为空白组、实验组、阴性对照组、脂质体组4组,应用RNAi技术将c-FLIP(L)基因对应的SiRNA片段转染入大肠癌细胞中,采用半定量RT-PCR法对前后FLIPmRNA水平变化进行判断,应用Western blot对FLIP蛋白水平变化进行分析,通过分析比较SiRNA片段转染前后TRAIL诱导的大肠癌细胞凋亡情况。结果 c-FLIP(L)基因对于人大肠癌细胞株SW480中的FLIPmRNA水平和FLIP蛋白水平有明显的降低作用,SiRNA片段转染后,有效遏制了大肠癌细胞株SW480的增殖,促进了癌细胞的凋亡,P<0.05,差异具有统计学意义。结论 c-FLIP(L)基因的RNAi靶向沉默能够促进大肠癌细胞的凋亡,具有一定应用前景的医用价值。

小干扰RNA靶向沉默整合素连接激酶基因对宫颈鳞状上皮细胞生物学行为的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)靶向沉默整合素连接激酶(ILK)基因对宫颈鳞状上皮细胞(H8细胞)增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法设计高效的靶向沉默ILK的siRNA,构建ILK-siRNA脂质体和无关对照质粒。将H8细胞随机分为ILK基因沉默组、阴性对照组和空白组,ILK基因沉默组H8细胞转染ILK-siRNA,阴性对照组细胞转染无关对照质粒,空白组细胞不转染任何序列,转染后继续培养48 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测H8细胞中ILK mRNA相对表达量,Western blot法检测H8细胞中ILK蛋白相对表达量,四甲基偶氮唑盐法检测H8细胞活力,Transwell实验检测H8细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,免疫组织化学法检测H8细胞内Ki-67蛋白表达。结果ILK基因沉默组H8细胞中ILK mRNA和蛋白相对表达量显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),阴性对照组与空白组H8细胞中ILK mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。ILK基因沉默组H8细胞活力显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组H8细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。空白组、阴性对照组和ILK基因沉默组H8细胞Ki-67蛋白阳性表达率分别为(20.01±0.31)%、(21.01±0.11)%、(12.01±0.01)%,ILK基因沉默组H8细胞Ki-67蛋白阳性表达率显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),阴性对照组与空白组H8细胞Ki-67蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。空白组、阴性对照组和ILK基因沉默组穿膜细胞数分别为28.13±2.44、30.24±2.15、18.52±2.25,ILK基因沉默组穿膜细胞数显著少于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。空白组、阴性对照组和ILK基因沉默组H8细胞迁移率分别为(15.51±4.88)%、(15.11±5.21)%、(6.91±5.12)%,ILK基因沉默组H8细胞迁移率显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),阴性对照组与空白组H8细胞迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论ILK参与调控宫颈鳞状上皮细胞的增殖、迁移以及侵袭,可能在宫颈癌的发生、发展中发挥重要作用;沉默ILK基因可以抑制H8细胞的增殖、迁移和侵袭能力,ILK有望成为宫颈癌靶向治疗的新靶点。

RNA干扰作用(RNAi)研究进展

RNA干扰作用 (RNAi)是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象 ,是基因转录后沉默作用 (PTGS)的重要机制之一 .RNAi主要通过dsRNA被核酸酶切割成 2 1～ 2 5nt的干扰性小RNA即siRNA ,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现 .RNAi要有多种蛋白因子以及ATP参与 ,而且具有生物催化反应特征 .RNAi是新发现的一种通过dsRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径 。

RNAi的不同沉默机制及其应用

RNAi即RNA干扰 ,又称为转录后基因沉默 ,是最近发展起来的一种快速关闭基因的新方法。通过外源或内源性的双链RNA(dsRNA)在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象 ,来研究正常基因的结构、功能及疾病的发病机制等。

一种快速构建单靶或双靶基因位点RNAi质粒载体的方法

目的开发一种快速构建RNA干扰(RNAi)质粒载体的方法。方法以pBluescriptⅡ质粒载体为母体,逆向导入人U6和H1启动子序列,仅用两条互补的寡核苷酸链,可快速构建单靶基因位点RNAi质粒载体;利用RNAi表达框两侧的MunⅠ及EcoRⅠ酶切位点,将多个干扰表达框串联,可快速构建多靶基因位点RNAi质粒载体;根据以上原则,构建针对绿色荧光蛋白(GFP)基因和萤火虫荧光素酶(LUC)基因的单靶点及双靶点RNAi质粒载体,以检测其干扰效果。结果构建的RNAi质粒载体可产生较理想的干扰效果,单靶点RNAi载体的干扰效率可达90%,双靶点RNAi载体的干扰效率可达87.5%。结论该方法可快速构建单靶点及双靶点的RNAi质粒载体,可在同一细胞内同时对多个靶基因实施有效的RNA干扰。

PCBP1基因RNAi序列的鉴定及其干扰效应的初步研究

以能与PCBP1mRNA特异结合的核苷酸片段(21个碱基对)构建shRNA真核表达载体并稳定转染Hela细胞,通过半定量RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光实验证实转染细胞中PCBP1的mRNA水平和蛋白质表达水平均被显著抑制.接着,本研究通过测定稳定转染Hela细胞的生长曲线、血清依赖性生长曲线和软琼脂集落形成率,证明PCBP1的沉默能够显著抑制细胞的生长增殖能力以及克隆形成潜能,揭示PCBP1可能直接或间接参与细胞周期的调控.本研究成功鉴定了沉默PCBP1基因表达的有效干扰片段,为下一步利用该有效干扰片段进行体内研究奠定了基础.同时,本研究的结果将有助于深入认识PCBP1蛋白在细胞周期调控和细胞癌变中的作用机制.

单链抗体靶向递送系统在RNA干扰中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA介)导的转录后基因沉默。随着医学的发展,通过RNAi来抑制靶基因的表达已经成为一种强有力的研究基因功能、验证药物靶标和治疗多种疾病的方法。然而,RNAi在哺乳动物中的治疗应用却受到基因递送系统的限制,即siRNA在体内递送的靶向性。目前,各种配体,如糖基化分子、肽类、蛋白质、抗体和基因工程抗体片段对于靶向递送siRNA具有巨大的应用潜力。它们改善了基因递送系统的有效性、特异性和安全性。本文主要就单链抗体-鱼精蛋白截短体融合蛋白在RNAi中的应用进行综述。

慢病毒介导的shRNA靶向干扰mTOR基因表达的稳定小鼠成纤维细胞株的建立

背景年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种严重影响视力的眼病。前期的研究发现蛋白激酶／雷帕霉素靶蛋白（Akt／mTOR）通路的激活与AMD的发病机制密切相关，寻找特异性抑制mTOR通路的方法成为治疗AMD的突破点。目的建立稳定抑制mTOR基因表达的小鼠成纤维细胞株，为探讨Akt／mTOR信号通路在AMD发生和进展中的作用提供细胞模型，观察TOR基因沉默对相关蛋白的影响。方法根据鼠源mTORmRNA序列设计并构建3对小发夹RNA（shRNA）干扰序列，分别与质粒GIPZ-GFP＋Puro载体连接，构建重组质粒；将重组质粒与慢病毒包装质粒共同转染小鼠成纤维细胞株NIH／3T3细胞，经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定细胞株，分别应用实时定量PCR和Western blot法检测NIH／3T3细胞中mTOR在基因及蛋白水平的表达变化，筛选出干扰效果最佳的shRNA序列。结果慢病毒感染NIH／3T3细胞3d后，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白（GFP）的表达，细胞的感染效率均达90％。实时定量PCR和Westernblot检测显示，NIH／3T3细胞中mTOR mRNA和蛋白表达电泳条带清晰、单一；低感染复数（MOI）下，shl组、sh2组和sh3组的NIH／3T3细胞敲低效率分别为31．3％、31．8％和45．3％，而在高MOI下，shl、sh2和sh3的敲低效率分别为47．1％、56．5％和71．6％。Westernblot检测发现，在低或高MOI下shl、sh2和sh3NIH／3T3细胞中mTOR蛋白的表达灰度条带均有不同程度的减弱，显示sh3为最有效的干扰靶点。结论成功构建了mTOR慢病毒表达载体并建立了稳定抑制mTOR基因表达的NIH／3T3细胞株。

RNAi鉴定药物靶点及siRNAs治疗疾病

RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。RNAi是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制,是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制,具有重大生物学意义。RNA干扰技术的发现及其作为基因敲除工具在模式生物、哺乳动物细胞和体内的成功应用的例子确保了它在药学研究中的作用。越来越多的研究显示RNAi在药物研发中显示出极大潜力,目前已有部分RNAi药物进入临床试验阶段。本文将从两个方面来论述RNAi在药学的应用:一是RNAi在药物靶点鉴定中的运用;二是siRNAs作为药物在疾病治疗中的作用。

IMM,Cenix,和Alnylam使用RNAi技术发现疟疾感染的新靶点

Alnylam制药公司（拥有领先RNAi治疗技术的公司）和Cenix BioScience GmbH（以RNAi技术为重点的合同研究组织）于2008-11—13公布，两家共同在PLoSPathogens杂志上发表了一项研究成果，即体内、外研究均证明RNAi可介导与疟疾感染有关的新型宿主基因沉默。

昆虫的RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种强有力的分子生物学技术,在昆虫研究中得到了较多的应用。目前,RNAi技术主要应用于昆虫功能基因和功能基因组研究,已在多个目的19种昆虫上实现了RNAi。在昆虫上实现RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、转基因和病毒介导等方法,这些方法各有特点,其中喂食法因其简单而最有应用前景。昆虫RNAi的系统性较为复杂,只有部分昆虫具有RNAi的系统性。昆虫中RNAi信号传导的基因可能是sid-1,但昆虫RNAi的系统性机理还不是很清楚。转基因植物产生的dsRNA实现了对作物的保护,证实了RNAi技术可用于害虫控制,为害虫控制开辟了新领域。昆虫的RNAi研究处在起步阶段,研究昆虫RNAi的机理,特别是RNAi在昆虫体内的系统性扩散机理,改进实现RNAi的方法,提高RNAi技术在昆虫研究中的应用,有利于昆虫基因功能鉴定和害虫控制,促进昆虫学科的发展。

RNA干扰

RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)是一种古老的生物抗病毒机制 ,能介导序列特异性的mRNA降解 ,是基因功能研究和蛋白组学的有效工具 ,在药物靶基因的筛选、抗病毒、肿瘤基因治疗等领域有很好的发展前景。

寄主诱导的基因沉默在改良作物抗病虫性方面的应用

根据RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理,在生物体内表达双链RNA(ds RNA)可以高效沉默生物体内基因的表达。在寄主中形成病原真菌和昆虫特异基因的小RNA会进入其体内从而产生寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)。病虫害对全球粮食安全构成极大的威胁,利用HIGS技术为提高农作物抗病虫性提供了有效的途径。综述了HIGS技术在提高农作物抗病虫性中的应用,总结了沉默信号在寄主与病虫间的可能的传递方式以及提出该技术存在的优缺点。

RNAi技术及其在基因组学研究中的应用

RNA干扰(RNA in terference,RNA i)是一种真核生物体内的基因调控机制.在介绍RNA i的作用机制及作用特点的基础上,综述了其在基因功能研究、基因组免疫系统、人类疾病的基因治疗及水产养殖病害的防治等基因组学研究领域的最新进展与应用.

RNA干扰用siRNA的体外转录合成

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具,而获得符合干扰要求的短双链干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)是进行RNA;研究的首要步骤。本研究建立了体外转录合成siRNA方法,并用其生成的siRNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白(GFP)基因和内源3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。结果显示,siRNA能特异性降低鸡成纤维细胞中内外源基因的表达。本实验认为这种以DNA为模板体外转录合成siRNA方法操作简单、成本低、产物得率高,值得从事RNA研究者参考借鉴。