小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

目的获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究。方法利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG在25℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase4B纯化。纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性。结果成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高。结论成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具。

家犬RNF141基因的电子克隆和初步分析

利用序列比对、拼接和软件预测等生物信息学方法成功克隆了家犬RNF141基因,其cDNA序列全长1450bp,含有一个编码231个氨基酸的完整开放阅读框。起始密码子侧翼序列符合Kozak规则。与人的RNF141基因进行比对,核酸序列同源性为90%,编码氨基酸序列相似性达96%。

斑马鱼rnf141基因结构与表达分析

目的:探讨斑马鱼rnf141基因在物种间进化以及在斑马鱼胚胎发育和成体中表达分布特点。方法:采用生物信息学方法分析斑马鱼rnf141基因结构特征;运用胚胎整体原位杂交和多组织RT-PCR技术分别检测斑马鱼胚胎发育不同阶段和成体各组织rnf141基因表达情况。结果:斑马鱼RNF141蛋白与人类和小鼠同源蛋白(ZNF230、Znf230)分别具有79.8%、78.5%的同源性,其中C3HC4型锌指结构域及其保守的半胱氨酸和组氨酸残基组成与人类(或小鼠)的同源性分别为84.8%、100%;而且,斑马鱼RNF141蛋白与人类ZNF230蛋白在C3HC4型锌指区域具有完全相同的二级结构。杂交结果显示,rnf141基因在斑马鱼胚胎中广泛表达,尤以端脑、小脑和后脑表达丰度为高。RT-PCR结果表明,rnf141基因在受检的成体组织中均有表达,但在睾丸组织中表达丰度较高。结论:斑马鱼rnf141基因为脊椎动物保守基因,并可能在胚胎发育和精子发生过程中起着重要作用。

人睾丸特异表达蛋白RNF141与特定DNA序列结合的初步研究

目的进一步证实RNF141的细胞核定位,初步筛选RNF141结合的DNA序列,了解其下游互作基因的信息。方法应用双重荧光免疫的方法,体外表达重组蛋白以及随机核苷酸序列筛选。结果发现了RNF141的细胞核定位,初筛得到RNF141结合的DNA序列,将此序列在人类启动子数据库比对后,发现1个候选基因。结论RNF141在生精调控中具有转录因子的某些特性。