非小细胞肺癌中过表达RNF146对Axin和β-catenin表达和定位的影响

目的:观察E3泛素连接酶RNF146表达对Axin和β-catenin蛋白表达的影响,探讨RNF146与Wnt/β-catenin信号通路在非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展中的作用。方法:应用免疫组织化学EnVision法检测133例NSCLC患者肺癌中RNF146、Axin和β-catenin的表达。构建RNF146过表达质粒,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和细胞免疫荧光方法研究RNF146在肺癌细胞株A549和LTE中过表达对Axin和β-catenin表达及定位的影响。结果:NSCLC患者肺癌组织中RNF146高表达72例(54.1%)中49例(68.1%)显示Axin表达减弱或缺失,19例(26.4%)出现β-catenin细胞核阳性表达;RNF146低表达61例(45.9%)中只有26例(42.6%)显示Axin表达减弱或缺失,7(11.5%)例出现β-catenin细胞核阳性。RNF146与Axin的表达呈明显的负相关(P=0.003),与β-catenin的细胞核表达呈正相关(P=0.047)。肺癌细胞系中过表达RNF146能够下调Axin蛋白的表达,诱导β-catenin蛋白表达和核内分布,但对Axin和β-catenin mRNA水平没有影响。结论:RNF146可能通过Wnt/β-catenin通路参与肺癌的发生发展。

RNF146真核表达载体的构建及其对非小细胞肺癌细胞系生物学行为的影响

目的构建E3泛素连接酶环指蛋白146(RNF146)基因真核表达载体,研究RNF146对非小细胞肺癌细胞系体外生物学行为的影响。方法采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法筛选RNF146低表达细胞系。构建pEX4-RNF146真核表达载体,经酶切和测序后瞬时转染LTE细胞,荧光显微镜观察、蛋白印迹法检测转染效率。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测肿瘤细胞体外增殖能力,划痕实验评价肿瘤细胞体外迁移能力,Buyden小室实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。结果酶切和基因测序证实重组质粒pEX4构建正确。MTT比色实验显示转染pEX4-RNF146组细胞增殖速度明显高于转染空载体组和未转染组(P<0.05)。划痕实验显示转染组细胞24h迁移率明显高于空载体组和未转染组(P<0.05)。Buyden小室实验结果表明转染组比空载体组和未转染组穿膜数目明显增多(P<0.05)。结论 RNF146基因转染能促进非小细胞肺癌LTE细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,可能是一个潜在的促肿瘤增殖、侵袭和转移的相关基因。

锌指蛋白146(RNF146)对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用

目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表达慢病毒,感染GC-1细胞上调rnf146的表达,Western blot验证过表达效率。评价RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及DNA损伤的保护作用。结果成功构建了p CDH-rnf146重组质粒并包装具有良好感染效率的RNF146过表达慢病毒。溴脱氧尿苷(Brd U)掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1增殖抑制。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)提示RNF146能够抑制吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论 RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。

shRNA沉默环指蛋白146基因对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及其相关蛋白表达的影响

目的:shRNA沉默环指蛋白146(RNF146)基因,观察非小细胞肺癌细胞中RNF146沉默对肺癌细胞迁移和侵袭及其相关蛋白表达的影响。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法用于筛选RNF146高表达肺癌细胞系。构建shRNA-RNF146真核表达载体,瞬时转染A549和H1299肺癌细胞,Western blot检测转染效率。划痕实验评价肺癌细胞体外迁移能力;Buyden小室实验检测肺癌细胞体外侵袭能力。Western blot检测肺癌细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达。结果:RT-PCR和Western blot方法筛选RNF146高表达肺癌细胞系,显示A549和H1299细胞中RNF146蛋白均高于其它细胞系。shRNA-RNF146转染A549和H1299细胞系后,划痕实验显示转染组细胞24小时迁移率明显低于空载体组和未转染组(P<0.01)。Buyden小室实验结果表明转染组比空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少(P<0.05)。Western blot检测与细胞迁移和侵袭相关的调控蛋白(MMP2、MMP7、MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等)的表达情况,结果显示干扰RNF146后A549细胞中MMP2和MMP7表达明显减少,而MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表达变化不明显。结论:RNF146可能通过调控MMP2和MMP7的蛋白水平促进肺癌细胞迁移和侵袭。

hsa_circRNA_0000596促进宫颈癌细胞侵袭和转移的机制研究

目的探讨hsa_circRNA_000596(circ-596)促进宫颈癌细胞侵袭和转移的作用机制。方法收集69例宫颈鳞状细胞癌(CSCC)手术患者的CSCC组织、癌旁正常宫颈组织及临床资料。采用RNA原位杂交(RISH)技术检测circ-596阳性表达情况,并分析其与CSCC患者临床特征的关系。采用Transwell实验检测宫颈癌细胞的侵袭能力;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测circ-596对下游靶基因的影响;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-197-3p对下游靶基因RNF146的调控作用;采用Rescue实验分析circ-596对miR-197-3p/RNF146信号通路及细胞侵袭能力的影响。结果circ-596在CSCC组织中主要呈阳性表达,阳性表达率为63.77%(44/69),高于癌旁正常组织的17.39%(12/69),差异有统计学意义(χ^(2)=8.254,P=0.004)。circ-596阳性表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移均密切相关(P<0.05)。Transwell实验结果显示,与对照细胞相比,过表达circ-596的宫颈癌细胞侵袭数目增加,敲低circ-596表达的细胞侵袭数目减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。生物信息学预测结果显示,miR-197-3p是circ-596的下游靶基因,RNF146是miR-197-3p的下游靶基因。qRT-PCR实验结果显示,过表达circ-596能下调miR-197-3p的表达,降低circ-596表达能上调miR-197-3p的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-197-3p与RNF146基因的3′UTR结合,从而抑制荧光素酶相对活性。Rescue实验结果显示,circ-596能够抑制miR-197-3p的表达,进而促进RNF146的表达,提升宫颈癌细胞的侵袭能力。结论CSCC组织中circ-596主要呈阳性表达,且其阳性表达情况与肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关。circ-596通过结合miR-197-3p,促进RNF146的表达,进而促进宫颈癌细胞的侵袭和转移。