鲤RNF2基因的克隆、组织表达与生物信息学分析

以鲤肾脏组织RNA为模板,扩增并克隆鲤环指蛋白2(RING Finger Protein 2,RNF2)基因的CDS区全长,分析其组织表达谱。结果显示,鲤RNF2基因的CDS区序列长1011 bp,编码336个氨基酸;该基因与鲫、斑马鱼、金头鲷、海洋青鳉鱼、鳕鱼、非洲爪蟾、尖尾娇鹟、小鼠、智人的同源性分别为98.2%、93.1%、78.0%、79.2%、79.2%、73.9%、78.1%、72.7%、72.7%;理化性质分析表明,RNF2蛋白分子质量为37.44 kD,理论等电点(pI)为6.28,脂肪系数为74.97%,不稳定指数为36.75,无跨膜结构和信号肽;亚细胞定位预测分析表明,该蛋白定位于细胞核(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞质(17.4%)和过氧化物酶体(4.3%)。蛋白质结构域分析表明该蛋白含RING结构域和RAWUL结构域,且RING结构域与斑马鱼、小鼠和智人完全一致;二级结构和三级结构表明,鲤鱼RNF2蛋白含有α-螺旋(35.12%)、延伸链(8.63%)、β-转角(0.89%)和无规则卷曲(55.36%);泛素化底物预测显示,TP53、IRF4、HIST2H2AC、H3F3B和HIST3H3作为RNF2蛋白的底物具有较高的置信度;实时荧光定量PCR结果显示,鲤RNF2基因在肌肉中表达量最高,其次是头肾和肝脏,在肾脏中表达量最低。这些结果为进一步研究RNF2在鲤鱼抗病毒应答中的作用提供了基础信息。

慢病毒介导RNF2基因表达对食管癌细胞X线照射后增殖与迁移等影响

目的 利用RNA干扰技术抑制人食管癌细胞中RNF2基因表达,观察其X线照射对细胞增殖活性、迁移能力、凋亡和细胞周期的影响.方法 培养人食管癌细胞ECA-109,RT-PCR检测RNF2 mRNA水平表达;MTT法检测ECA-109食管癌细胞细胞增殖;蛋白印迹法检测ECA-109-R细胞中RNF2蛋白表达变化;流式细胞技术检测照射后不同时间细胞周期和凋亡变化.Transwell侵袭小室模型检测转染对食管癌细胞迁移能力的影响.重复测量设计资料方差分析.结果 照射组食管癌细胞中RNF2 在mRNA水平和蛋白表达水平均较未照射组明显增加（P〈0.01）,且存在剂量-效应关系;MTT结果显示食管癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低（P〈0.01）;ECA-109-R组细胞中BMI1、RNF2蛋白表达水平较ECA-109组和ECA-109-N组细胞明显降低（P〈0.01）,ECA-109组与ECA-109-N组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;Transwell侵袭小室模型检测结果显示照射后3.5 h ECA-109-R组穿膜细胞数明显低于ECA-109组和ECA-109-N组（P〈0.01）.6 Gy照射后各实验组处于G2＋M期比例明显高于相应未照射组（P〈0.01）,且ECA-109-R组处于G2＋M期的比例均明显低于照射后的ECA-109组和ECA-109-N组（P〈0.05）.照射后ECA-109-R组细胞凋亡率明显高于ECA-109组和ECA-109-N组（P〈0.01）.结论 采用RNA干扰技术降低食管癌细胞中RNF2的表达,降低细胞增殖和迁移能力,解除照射后G2＋M期阻滞,促进细胞凋亡,增加放射敏感性.

沉默RNF2基因对ECA109细胞裸鼠移植瘤体内放射增敏效应的影响

目的探讨沉默食管癌ECA109细胞RNF2基因对裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。方法将36只BALB/c/nu裸鼠随机分为对照组、对照+照射组、空载组、空载+照射组、沉默RNF2组、沉默RNF2+照射组,于裸鼠皮下接种ECA109细胞构建裸鼠移植瘤模型,给予X线照射3 Gy5次。自接种后第14天开始每2~3d测量1次瘤最大径(a)和最短径(b),记录成瘤时间并按公式计算瘤体积(ab^2/2),绘制生长曲线。自首次照射24 h后每组处死3只,qRT-PCR和免疫组织化学法分别检测各组瘤组织中RNF2 mRNA和蛋白表达;观察各组剩余瘤照射后生长情况和体积变化。采用TUNEL法检测各组瘤组织细胞凋亡情况,分别采用qRT-PCR和免疫组织化学法检测各组瘤组织中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达情况。结果对照组与空载组瘤生长速度最快,沉默RNF2后生长速度减慢,沉默RNF2+照射组瘤生长速度最慢(P<0.05)。照射后各组凋亡水平均明显高于照射前(P<0.05),照射前、照射后RNF2沉默组凋亡水平均高于对照组、空载组(P<0.05)。照射前RNF2沉默组细胞中RNF2 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组、空载组(P<0.05),照射后这种趋势更明显。与对照组、空载组相比,照射前、照射后RNF2沉默组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平均下降(P<0.05);Bax mRNA和蛋白的表达水平均上调(P<0.05)。结论体内研究显示沉默RNF2基因有效增加了食管癌ECA109细胞裸鼠移植瘤组织放射敏感性,这与诱导细胞凋亡密切相关。