RNF5调控HRD1泛素化参与大鼠妊娠期糖尿病发展的机制研究

目的探究E3泛素蛋白连接酶(E3 ubiquitin protein ligase,RNF5)调控泛素连接酶复合物(ubiquitin ligase complex1,HRD1)及其泛素化修饰过程参与妊娠期糖尿病发展的分子机制。方法对SPF级怀孕SD大鼠进行STZ注射构建妊娠期糖尿病模型,将大鼠随机分为对照组(n=15)、模型组(n=15)、NC组(n=15)和si-RNF5组(n=15),其中NC组转染NC质粒,si-RNF5组转染si-RNF5质粒,对照组和模型组给与等量生理盐水。HE染色检测各组大鼠肾脏组织病理变化;大生化检测血清肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿蛋白,血糖仪检测空腹血糖,通过qPCR和Western blot检测肾脏组织RNF5和HRD1的mRNA和蛋白表达水平及泛素化修饰水平。结果HE染色结果表明敲除RNF5后能显著降低妊娠期糖尿病大鼠肾脏损伤;降低外周血Scr、BUN、尿蛋白和空腹血糖水平,并且显著抑制HRD1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01),同时降低HRD1的泛素化修饰过程。结论敲除RNF5可以降低妊娠期糖尿病大鼠肾脏损伤,其机制可能与抑制RNF5信号通路泛素化有关。

乳腺癌中环指蛋白5(RNF5)基因表达水平的研究

目的探讨乳腺癌中RNF5基因mRNA和蛋白表达水平的变化。方法取51例乳腺癌标本,并以癌旁正常组织为对照,应用半定量RT-PCR方法检测乳腺癌中RNF5基因mRNA表达水平,应用Western印迹杂交方法检测相应标本中蛋白表达水平。结果在51例标本中,31例癌组织中RNF5mRNA表达水平高于癌旁正常组织,33例中RNF5蛋白表达水平增高,经统计分析两组差异显著(P<0.05)。结论RNF5基因在乳腺癌中存在高表达,这可能是乳腺癌发生发展的另一新的分子机制。

乙型肝炎病毒HBx蛋白诱导肝细胞泛素连接酶RNF5抑制STING/IFN-β信号通路的研究

目的研究乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBx)对HepG2细胞STING/IFN-β信号通路的影响及其可能存在的机制。方法将含HBV全基因组1.5倍复制子质粒pHBV-48和缺失HBV X基因的HBV复制子质粒pHBV-48-X_(0)分别转染至HepG2细胞,采用细胞免疫荧光染色法观察细胞内HBx蛋白表达情况,同时采用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞内干扰素基因刺激因子(STING)基因表达水平及蛋白含量。分别转染空载体pEGFP-N1和HBV编码X基因表达质粒pEGFP-HBx至HepG2细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞内STING及环指蛋白5(RNF5)基因和蛋白含量。采用基因干扰技术减少转染质粒的HepG2细胞RNF5表达,Western blot检测细胞STING、干扰素β(IFN-β)蛋白表达情况;以不同浓度蛋白酶抑制剂MG132处理转染pEGFP-HBx的HepG2细胞,Western blot检测细胞内STING、IFN-β蛋白表达情况。结果转染空载体、pHBV-48及pHBV-48-X_(0)的HepG2细胞STING基因相对含量差异无统计学意义(P>0.05);转染空载体的HepG2细胞STING蛋白(1.14±0.11)相对表达水平较转染pHBV-48的HepG2细胞(0.47±0.09)显著升高(P<0.01),但低于转染pHBV-48-X_(0)的HepG2细胞(2.15±0.18)(P<0.01)。转染空载体及pEGFP-HBx的HepG2细胞STING基因相对含量差异均无统计学意义(均P>0.05),但转染pEGFP-HBx的HepG2细胞STING蛋白(0.48±0.16)相对含量较转染空载体的细胞(0.87±0.22)显著降低(P<0.01);与转染空载体的HepG2细胞相比,转染pEGFP-HBx的HepG2细胞RNF5基因相对表达水平及蛋白相对含量均显著升高(均P<0.01)。减少HepG2细胞RNF5表达后,细胞内STING和IFN-β相对蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。随着蛋白酶抑制剂MG132浓度逐渐升高,表达HBx的HepG2细胞内STING和IFN-β蛋白相对含量逐渐上升。结论乙型肝炎病毒可能通过病毒编码蛋白HBx上调肝细胞泛素连接酶RNF5进而抑制STING/IFN-β信号通路。

抗病毒天然免疫通路中IRF-3调控新机制

干扰素调节因子-3(interferonregulatoryfactor-3,IRF-3)是IRF家族中重要转录因子之一,在调控干扰素(interferon,IFN)基因表达和抗病毒天然免疫反应中具有重要作用.最新发现的MITA(mediator of IRF-3 activation,又称STING/ERIS)蛋白是宿主抗病毒天然免疫反应中的一种重要调节分子.病毒侵染时,MITA与IRF-3相互作用,特异性激活IRF-3,并募集TANK结合激酶1(TANKbindingkinase 1,TBK1)与IFN通路中的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS(mitochondrial anti-viralsignaling protein)形成复合物,且MITA可被TBK1磷酸化,诱导Ⅰ型IFN及IFN刺激基因(interferonstimulate genes,ISG)的表达,诱发抗病毒天然免疫反应.同时还发现,泛素连接酶RNF5(ringfingerprotein 5)可对MITA发生泛素化修饰从而抑制其对IRF-3活化,实现对宿主抗病毒天然免疫反应负调节作用.本室研究发现,严重性急性呼吸系统综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndromecoronavirus,SARS-CoV)和人类新型冠状病毒(human coronavirus NL63,HCoV-NL63)的木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLP)利用其特有的去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)活性,通过宿主细胞泛素-蛋白酶体信号系统对IRF-3的泛素化等翻译后修饰进行调节,从而成为该种病毒逃逸机体抗病毒防御系统主要手段之一.