ROCK抑制剂对脑出血大鼠脑白质损伤的影响

目的探讨ROCK抑制剂盐酸法舒地尔对脑出血大鼠神经功能缺损的保护作用。方法运用立体定位仪,取大鼠尾动脉不凝血造内囊出血模型。Wistar雄性清洁级大鼠分成3组:假手术组、脑出血组(ICH组)、盐酸法舒地尔组(治疗组)。治疗组于出血后24h开始按12mg/(kg·d)腹腔注射盐酸法舒地尔,连续7d;假手术组和脑出血组用等量的生理盐水腹腔注射作为对照。运用Bederson大鼠神经功能缺损评分方法对各组进行评分。断头取脑后,行改良三色染色法染色,观察脑组织的病理变化。结果盐酸法舒地尔能够明显改善脑出血大鼠的神经功能缺损程度,减轻神经纤维髓鞘脱失及轴突断裂等病理变化。治疗组血肿周围含水量和神经功能评分均较ICH对照组降低(P<0.05),而较假手术组明显升高(P<0.05)。结论盐酸法舒地尔可以有效改善脑出血大鼠神经功能缺损情况。

ROCK抑制剂Y-27632在体外培养的兔角膜内皮细胞紫外线损伤修复中的作用

目的探讨ROCK抑制剂Y-27632在兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells,RCECs)紫外线损伤修复中的作用。方法收集30只健康成年新西兰大白兔的角膜,显微镜下撕除角膜后弹力层和内皮层,用胰蛋白酶消化法获得原代RCECs。选取第2代处于对数生长期的RCECs分为三组A组为正常对照组,RCECs为常规培养液培养;B组为紫外线照射组,RCECs经紫外线照射20 s制备细胞损伤模型,常规内皮细胞培养液培养;C组为紫外线照射+Y-27632组,在细胞损伤模型中加入终浓度10μmol·L^(-1)的Y-27632细胞培养液培养。采用MTT比色法检测各组细胞活性。采用Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移能力。利用BrdU细胞增殖实验检测各组细胞的增殖能力。运用细胞黏附实验检测各组细胞黏附性。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞周期蛋白(CyclinD1)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKN1B)mRNA的相对表达量。Western blot法检测各组CyclinD1和细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk2)的表达情况。结果MTT比色法检测结果显示,B组细胞的活性(80.61±3.40)%低于A组(100%)和C组(92.55±4.56)%,差异均有统计学意义(P=0.000、0.025)。Transwell迁移实验结果显示,B组迁移细胞数目(39.3±4.4)个/高倍视野较A组(77.0±6.7)个/高倍视野和C组(54.3±3.4)个/高倍视野减少,差异均有统计学意义(P=0.023、0.015)。BrdU细胞增殖实验检测结果显示,B组细胞光密度值(0.24±0.05)较A组(0.35±0.08)和C组(0.30±0.07)降低,差异均有统计学意义(P=0.001、0.015)。细胞黏附实验结果显示,B组细胞黏附性(0.183±0.010)较A组(0.541±0.010)和C组(0.353±0.030)下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000)。实时荧光定量PCR检测结果显示,与A组相比,B组的CyclinD1 mRNA相对表达量(0.49±0.10)下降,CDKN1B mRNA相对表达量(1.25±0.20)上调,差异均有统计学意义(P=0.003、0.002);C组CyclinD1 mRNA的相对表达量(0.80±0.12)比B组(0.49±0.10)增加,C组CDKN1B mRNA的相对表达量(0.90±0.16)比B组(1.25±0.20)减少,差异均有统计学意义(P=0.013、0.022)。Western blot检测结果显示,B组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量分别为(0.21±0.09)和(0.38±0.10),均低于A组(0.43±0.12)、(0.62±0.19),差异均有统计学意义(P=0.014、0.005);C组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量分别为(0.34±0.11)和(0.51±0.14),均高于B组,差异均有统计学意义(P=0.027、0.002)。结论ROCK抑制剂Y-27632能增强紫外线损伤的RCECs活性,促进细胞迁移、黏附和增殖。

ROCK抑制剂Y-27632对TGF-β1/CTGF通路的影响

Y-27632为嘧啶衍生物,是一种近年来合成的特异性Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase,R O C K)抑制剂,能通过调控R O C K介导的多种生物效应从而抑制肝纤维化的形成.研究发现,转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)通路参与肝纤维化的形成,TGF-β1诱导其下游效应分子CTGF表达,促使细胞外基质生成增多,导致肝纤维化.Y-27632具有抑制TGF-β1和CTGF表达的作用,本文从ROCK抑制剂Y-27632对TGF-β1/CTGF通路的影响来阐述Y-27632的抗纤维化作用,借此更深入的了解Y-27632的作用靶点,为肝纤维化的靶向治疗提供理论依据.

ROCK抑制剂治疗心血管疾病的研究进展

ROCK为Rho相关的卷曲蛋白激酶，其表达上调常引起平滑肌细胞收缩异常，导致冠状动脉痉挛、动脉粥样硬化、心肌肥厚和肺动脉高压等，因此ROCK抑制剂对这些心血管疾病的发生发展有一定抑制作用，但临床应用尚需更多的研究来证实，本文就ROCK抑制剂在心血管疾病的应用作一综述。

损伤角膜修复重建中的ROCK抑制剂:促进角膜细胞增殖、迁移和黏附

背景:随着人们对Rho/ROCK通路的生物学功能的了解的不断加深,新的ROCK抑制剂不断被发现,且ROCK抑制剂在角膜细胞存活、增殖和迁移中表现出良好的促进效果,ROCK抑制剂的研究能为再生医学和临床细胞移植提供更多的良好供体材料或种子细胞。目的:总结并探讨ROCK抑制剂Y-39983和Y-27632在角膜病的治疗和应用的研究进展。方法:应用计算机检索Pub Med数据库和中国知网数据库内相关文章,检索时间为2008至2015年,检索词为"corneal endothelial cell,corneal epithelial cell,ROCK inhibitor,Y-39983,Y-27632,ROCK抑制剂,角膜",从中筛选出与主题相关的部分文献。结果与结论:初检得到264篇文章,按主题相关性对文献进一步筛选,最终纳入45篇文章进行讨论。应用到眼科的ROCK抑制剂主要有两种:Y-27632和Y-39983,两者的应用主要还是基础研究与临床试验阶段。Y-27632可促进角膜缘上皮干细胞增殖及提高冻存复苏后的活性;Y-39983作为一种新型的ROCK抑制剂,其比Y-27632更有效地抑制ROCK激酶的活性,从而能更有效地促进角膜内皮的愈合。目前ROCK抑制剂在角膜治疗的研究较多,但是没有建立一种稳定的获得种子细胞的方法,每一种治疗方法都各有优缺点,而克服这些缺点以及找到快速稳定获得种子细胞的方法是今后的发展方向。

ROCK抑制剂在眼科基础及临床应用研究进展

ROCK抑制剂治疗青光眼的有效性在临床观察中已得到证实,一些动物及细胞实验中亦发现其对糖尿病视网膜疾病、增殖性视网膜疾病、角膜内皮功能障碍及角膜新生血管有良好的治疗作用。此外,ROCK抑制剂在部分基础研究中也显示出良好的神经保护作用。随着ROCK抑制剂的应用价值日益凸显,其在眼科领域将会有更为广阔的发展空间和应用前景。

不同生长期小鼠胸腺T细胞不同亚群的变化及ROCK抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用

目的研究各发育阶段小鼠胸腺细胞、胸腺上皮细胞(TEC)和脾脏中T细胞的变化,探索Rho相关卷曲蛋白激酶(ROCK)抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的作用。方法取幼年、青年、中年及老年期C57BL/6雌鼠的胸腺和脾脏,流式细胞术分析小鼠胸腺细胞、TEC及脾脏中T细胞亚群;ROCK抑制剂体外处理衰老进程中小鼠TEC,荧光酶联斑点分析仪观察细胞增殖情况;ROCK抑制剂处理20月龄衰老小鼠,流式细胞术检测小鼠胸腺细胞、TEC及脾脏中T细胞亚群的变化。结果随月龄增加,胸腺细胞、TEC总数及各细胞亚群数量均显著降低;脾脏中总CD4^(+)T细胞及CD8^(+)T细胞比例无显著性改变,但CD4+初始T细胞、CD8+初始T细胞和CD4+近期胸腺迁出细胞(RTE)在脾脏中所占比例呈下降趋势;ROCK抑制剂在体外促进衰老进程中小鼠TEC增殖,ROCK抑制剂在体内使衰老小鼠胸腺细胞、TEC以及外周脾脏中T淋巴细胞各亚群数量明显增加。结论随着小鼠月龄增加,胸腺呈进行性退化。ROCK抑制剂可以显著缓解衰老小鼠胸腺的萎缩,促进衰老小鼠胸腺再生。

基于分子对接和自由能计算的高活性苯并噻唑类ROCK抑制剂的设计、合成和生物学评价

以3个已报道的苯并噻唑类Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂(化合物1~3)为研究对象,经分子动力学模拟获得其在ROCK2蛋白结合口袋中的稳定结合构象,通过分子对接结果从氨基酸角度初步揭示了此类抑制剂的结构-活性关系(SAR);然后,对这3个抑制剂进行MM/GBSA结合自由能(ΔG_(bind))研究,结合自由能计算可知ΔG_(bind)与化合物活性之间具有良好的相关性,且范德华作用能(ΔG_(VDW))对ΔG_(bind)的贡献最大.通过自由能分解获得了对于高活性抑制剂具有重要影响的关键残基.最后,根据分子对接和自由能研究结果设计并合成了3类新型苯并噻唑类似物(D1~D10).生物学评价结果表明,这10个化合物分别具有11~288 nmol/L(ROCK1)和2~105 nmol/L(ROCK2)的抑制活性.其中,化合物D3~D5在人肝微粒体代谢研究中展现出比已报道化合物更高的代谢稳定性.本研究不仅为高活性ROCK抑制剂的设计提供了理论指导,也为ROCK的应用研究提供了一系列结构新颖的高活性抑制剂.

ROCK选择性抑制剂Y-27632提高小鼠胚胎干细胞传代效率研究

以小鼠胚胎干细胞(ES细胞)为研究对象,探讨ROCK选择性抑制剂Y-27632在细胞传代过程中的作用,并对ES细胞相关生物学特性进行检测。结果表明:Y-27632能够引起ES细胞形态发生改变,通过Y-27632的添加能够使质地紧密的ES细胞集落变得松散、扁平。将Y-27632应用于ES细胞传代,能够显著提高传代效率。并且,在Y-27632长期存在的条件下,ES细胞依旧维持稳定的染色体数目,较强的碱性磷酸酶活性,在体内能够分化形成畸胎瘤,在体外能够分化形成心肌细胞。说明Y-27632的使用能够显著提高小鼠ES细胞的传代效率;紧密的细胞连接不是维持ES细胞多能性的必要条件。

人细支气管上皮细胞的ROCK激酶抑制剂培养体系扩增及气液相模型的建立

背景:人类原代肺脏上皮细胞在体外难以分离培养,表现为组织来源有限、细胞存活率低、增殖速度慢,缺乏上皮细胞表型分化能力等。目的:体外扩增人细支气管上皮细胞,建立其气液相分化模型,用于肺脏上皮细胞功能研究。方法:采用Pronase和DnaseⅠ联合消化法分离人细支气管上皮细胞。利用ROCK激酶抑制剂培养体系对其进行扩增,免疫荧光染色鉴定细胞类型。建立气液相培养模型,扫描电镜、相差显微镜和免疫荧光染色鉴定细胞分化类型。结果与结论:通过ROCK激酶抑制剂培养体系,体外成功培养扩增了人细支气管上皮细胞。扩增细胞经免疫荧光染色鉴定绝大部分都表达基底细胞标记角质蛋白14,提示人细支气管的基底细胞可能是肺脏上皮干细胞的主要亚群。同时,扩增细胞在气液相培养条件下分化成纤毛细胞和无纤毛柱状细胞,表明ROCK激酶抑制剂培养体系扩增的上皮细胞仍然保持干细胞的增殖分化能力,体外气液相培养模型可以促进人细支气管上皮细胞分化。

Rho相关蛋白激酶及其抑制剂的研究进展

Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)1、2属于丝氨酸-苏氨酸激酶AGC家族,对细胞多种生物学功能均有调节作用。抑制ROCK已经被证实可用于多种疾病的潜在治疗。笔者将简要介绍ROCK的结构和治疗的重要性,以及最新关于ROCK抑制剂的研究进展。

甲基莲心碱通过阻断ROCK通路抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭

目的验证甲基莲心碱(neferine,Nef)通过阻断ROCK通路对非小细胞肺癌H1299细胞迁移和侵袭的抑制作用。方法取H1299细胞体外培养,经不同浓度的Nef处理,CCK-8法检测H1299细胞活力确定实验组浓度。细胞划痕、Transwell小室实验检测H1299细胞的迁移和侵袭能力,酶联免疫吸附法检测肺癌细胞分泌的基质金属蛋白MMP-2、MMP-9的表达,实时荧光定量PCR和Western blot法检测H1299细胞ROCK1蛋白水平;应用AutoDock半柔性对接方法模拟了Nef与ROCK1之间的结合模式和亲合力。结果结论Nef作为一种潜在的抗癌天然化合物,通过下调与肿瘤细胞迁移和侵袭相关分子MMP-2、MMP-9和ROCK1的表达,进而发挥抑制非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭的作用。

Y-27632通过抑制ROCK通路降低内皮细胞中基质金属蛋白酶2和9表达

目的:探讨ROCK通路抑制剂Y-27632对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)基质金属蛋白酶2和9(matrix metalloproteinase 2 and 9,MMP2,MMP9)的表达与活性的影响。方法:体外培养原代HUVEC,分别予以TNF-α(25 ng/m L)、TNF-α+Y-27632(10μmol/L)处理24 h。Real-time PCR检测血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、MMP2和MMP9 m RNA的表达水平;明胶酶谱检测MMP2和MMP9蛋白活性的改变情况。结果:与对照组相比,TNF-α明显上调ICAM-1,VACAM-1,MMP2,MMP9 m RNA的表达(P<0.01)和MMP2,MMP9的蛋白活性(P<0.05);与TNF-α处理组相比,Y-27632可显著抑制ICAM-1,VCAM-1,MMP2和MMP9 m RNA的表达(P<0.01),下调MMP2和MMP9的蛋白活性(P<0.05)。结论:Y-27632可以抑制TNF-α诱导的HUVEC炎症反应和MMP2,MMP9 m RNA和蛋白活性水平。

法舒地尔促进大鼠坐骨神经横断伤后的轴突与髓鞘再生及功能恢复

目的 探讨法舒地尔在改善周围神经损伤后的轴突与髓鞘再生及功能恢复的效果。方法SD大鼠30只,重(200±30)g,切断右侧坐骨神经,缝合后等分入2组,即对照组与法舒地尔组,分别给予生理盐水与10mg/kg的盐酸法舒地尔腹腔注射。术后2周,利用NF-200一抗对损伤远端的轴突密度进行评估。术后4周,利用逆行示踪剂荧光金评估发出轴突进入损伤远端的位于L4~6DRG和腰骶膨大处的神经元数量。术后12周,对腓肠肌的湿重比、肌纤维的横截面积进行测量;利用NF-200与MPZ一抗及透射电镜对轴突的直径与髓鞘的厚度进行测量。术后4、6、8、10、12周采集足印,对两组大鼠坐骨神经功能指数(SFI)进行评定。此外,体外培养大鼠胚胎脊髓背根神经节(DRG)和脊髓运动神经元(SMN),评估法舒地尔对其轴突生长的影响。结果 术后14 d,法舒地尔组损伤远端神经密度显著高于对照组(P=0.034)。术后4周法舒地尔组被荧光金逆行标志的L4~6DRG及脊髓前角运动神经元数目均显著高于对照组(P<0.05)。术后12周,法舒地尔组有髓轴突的数量、有髓轴突的直径以及髓鞘的厚度都高于对照组(P<0.05),G-ratio值则低于对照组(P<0.05)。SFI数据结果显示,术后6、8、10及12周,法舒地尔组SFI值显著优于对照组(P<0.05)。术后12周,对照组的患侧腓肠肌的湿重比及肌纤维的横截面积显著小于法舒地尔组(P<0.01)。培养5 d后,法舒地尔组DRG及SMN的轴突显著长于对照组(P<0.01)。结论 法舒地尔能够促进大鼠坐骨神经横断伤后的轴突与髓鞘再生及其运动功能恢复。

Rho激酶(ROCK)在糖尿病并发症中的研究

ROCK(Rho-associated protein kinase),即Rho相关蛋白激酶,是Rho/ROCK通路的重要蛋白。ROCK与GTP(guanosine triphosphate)结合蛋白Rho相互作用,通过磷酸化激活多种下游蛋白或核因子,在机体的各项调节功能中起到重要的作用。研究表明,糖尿病患者体内ROCK异常上调,可能是导致糖尿病并发症的重要原因,最终危及患者心血管系统、泌尿系统乃至生殖系统。而对ROCK的深入研究表明,使用ROCK的拮抗剂,如法舒地尔等,可有效抑制ROCK/Rho通路,最终缓解糖尿病并发症。

RhoA/ROCK信号通路在妊娠相关疾病中的研究进展

RhoA/ROCK信号通路是一种多功能通路,其参与了广泛的生物和细胞生理功能和活动,在维持生理活动及疾病发生中发挥了重要的作用。大量研究表明,RhoA/ROCK信号通路在分娩过程、胚胎着床与发育等方面的调控中都发挥着重要作用,RhoA/ROCK信号通路的异常与产科疾病相关。本文基于RhoA/ROCK信号通路的相关研究,结合最新的一些研究进展,就RhoA/ROCK信号通路在妊娠相关疾病中的调控作用作一系列综述。

RhoA/ROCK信号通路与心肌梗死关系的研究进展

心肌梗死是心血管疾病死亡的主要原因。其发病机制尚未完全阐明,研究发现RhoA/ROCK信号通路在内皮功能障碍、炎症反应、氧化应激、内质网应激和细胞凋亡等过程中起关键作用,与心肌梗死的发生和发展紧密相关。ROCK抑制剂也为心肌梗死的治疗提供了一条新思路。现就近年RhoA/ROCK信号通路在心肌梗死中的发病机制做一综述。

RhoA/ROCK信号通路与PM2.5相关疾病的研究进展

PM2.5沉积在肺部,会导致不可逆的肺间质纤维化,目前尚无有效救治手段。RhoA/ROCK信号通路是调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路,与多种细胞功能密切相关。已有研究表面,RhoA/ROCK信号通路的激活或表达上调,与PM2.5相关疾病的发生发展密切相关,且ROCK抑制剂能显著缓解PM2.5相关疾病。该文就RhoA/ROCK信号通路与PM2.5相关疾病的关系进行综述,以期梳理RhoA/ROCK信号通路在PM2.5相关疾病中的作用机制,为PM2.5相关疾病的干预治疗提供理论依据,并为ROCK抑制剂的临床应用奠定基础。

基于吲哚类的ROCK激酶抑制剂定量构效关系的研究

基于计算生物学方法对61个ROCK激酶靶标分子建立三维定量构效关系(3DQSAR)模型.在基于配体叠合的基础上,发现CoMSIA中2个场组合(位阻场和疏水场)为最好的模型(Q2=0.509,R2ncv=0.987,SEE=0.131,F=287.999和R2pre=0.837).基于此模型基础上的三维等势线图形象地说明了在各个位置增加疏水性的大取代基或者亲水性基团有利于提高分子的生物活性.此外,分子对接模拟结果显示了氨基酸Glu170,Met172和Asp232在受体调节剂中发挥着重要作用.这些结果能够帮助深入了解ROCK激酶的作用机理,并且能够为今后的药物设计提供新的方向.

调控量子点对小鼠胚胎干细胞活性影响的研究

目的:探讨调控量子点对小鼠胚胎干细胞活性的影响。方法:通过微波合成法制备荧光性能优越的量子点,并在体外对小鼠胚胎干细胞进行标记,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察分析量子点对小鼠胚胎干细胞标记率、活力、增殖等方面的影响,并通过ROCK抑制剂Y-27632调控小鼠胚胎干细胞的活力和增殖能力。结果:用20 nmol.L-1的量子点标记小鼠胚胎干细胞培养24 h后,小鼠胚胎干细胞的标记率达到92.5%,存活率只有40.7%;使用10μmol.L-1Y-27632调控量子点标记的小鼠胚胎干细胞培养24 h后,小鼠胚胎干细胞的存活率提高20%。结论:量子点的浓度越大,小鼠胚胎干细胞的标记率越高,成活率越低,添加Y-27632可以阻止量子点标记的胚胎干细胞的凋亡,明显增加胚胎干细胞的生物活性。