SLC9A3-AS1调控miR-148a-3p/ROCK1信号轴影响肾癌细胞生物学功能

目的检测lncRNA SLC9A3-AS1在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)组织与肾癌细胞中的表达水平,探讨其促进肾癌细胞恶性生物学行为的机制。方法应用GEPIA2在线软件(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析TCGA数据库中SLC9A3-AS1在ccRCC组织中的表达水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SLC9A3-AS1在不同肾癌细胞系、24例ccRCC组织与癌旁正常肾脏组织中的表达水平;应用细胞增殖/毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和Transwell小室迁移实验检测敲低SLC9A3-AS1表达对肾癌细胞增殖与迁移的影响;应用蛋白质免疫印迹法检测增殖与迁移相关信号通路蛋白的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证SLC9A3-AS1与miR-148a-3p/ROCK1轴的靶向调控关系。结果GEPIA2软件分析结果显示,相较正常肾脏组织,SLC9A3-AS1在肾透明细胞癌组织中表达显著上调(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,相较癌旁正常肾脏组织,SLC9A3-AS1在24例ccRCC组织中表达显著上调(P<0.01);相较永生化肾小管上皮细胞,SLC9A3-AS1在4种肾癌细胞系中表达均显著上调,以786-O细胞最为显著(P<0.01)。干扰SLC9A3-AS1表达,可显著抑制786-O细胞的增殖与迁移能力,上调E-cadherin的蛋白表达水平,而下调N-cadherin、MMP2的蛋白表达水平(均P<0.05);过表达miR-148a-3p可显著抑制786-O细胞的增殖与迁移能力(P<0.01)。双荧光素酶报告基因检测结果表明,SLC9A3-AS1可特异性结合miR-148a-3p,后者进一步靶向结合ROCK1 mRNA的3′UTR区域;过表达miR-148a-3p可明显下调ROCK1 mRNA的表达水平,敲低miR-148a-3p表达则产生相反的效应;敲低SLC9A3-AS1表达可显著下调786-O细胞中ROCK1 mRNA与蛋白的表达水平(P<0.01);下调miR-148a-3p表达可部分逆转SLC9A3-AS1沉默对786-O细胞增殖与迁移的抑制作用(P<0.05)。结论SLC9A3-AS1在ccRCC中通过调控miR-148a-3p/ROCK1轴发挥促癌作用,有望成为ccRCC的一个新的分子标志物。

生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1调控滋养层细胞功能障碍的研究

目的 分析生物钟基因脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白类似蛋白1(BMAL1)对Ras同源物基因组成员A(RhoA)/Rho相关激酶1(ROCK1)信号通路的影响以及对滋养层细胞生物学功能的调控机制。方法 选择滋养层细胞系JEG3细胞,根据转染BMAL1过表达质粒以及添加1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L ROCK1抑制剂Y27632,分为对照组、BMAL1组、BMAL1+1μmol/L Y27632组、BMAL1+2μmol/L Y27632组、BMAL1+5μmol/L Y27632组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BMAL1、RhoA、ROCK1以及上皮-间充质转化(EMT)标记物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug的mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;CCK8法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分别检测细胞周期、凋亡以及胞内活性氧(ROS)水平。结果 JEG3细胞过表达BMAL1后,与对照组相比,ROCK1 mRNA表达显著增加(P<0.01),RhoA mRNA表达增加但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,BMAL1组N-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。在蛋白水平,BMAL1组ROCK1、RhoA及Snail蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05),Y27632处理可以显著降低Vimentin及Snail蛋白表达(P<0.05)。此外,与对照组相比,BMAL1组细胞活力显著增加(P<0.001),BMAL1+Y27632各浓度组较BMAL1组细胞活力显著降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与对照组相比,BMAL1组细胞周期由G0/G1期向S+G2/M期转化,细胞总凋亡率有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05),胞内ROS水平显著降低(P<0.01);与BMAL1组相比,BMAL1+1μmol/L Y27632组和BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞早期凋亡率及总凋亡率显著增加(P<0.05),BMAL1+1μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度增加但差异无统计学意义(P>0.05),BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度较BMAL1组显著增加(P<0.001)。结论 生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1表达参与调控滋养层细胞增殖、DNA合成、凋亡及氧化应激水平。

脂多糖激活LRG1/ROCK1信号轴调控中性粒细胞炎症反应

目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)调控富含亮氨酸α-2糖蛋白1(leucine-rich α-2 glycoprotein 1, LRG1)/Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK1)信号轴在中性粒细胞炎症反应中的作用。方法 1μmol/L全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)和12.5 mL/L二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)联合诱导人早幼粒白血病HL-60细胞72 h和96 h后,Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达变化。LPS诱导dHL-60细胞和健康人外周血中性粒细胞活化,qPCR和ELISA法分别检测LRG1、ROCK1以及炎性因子的转录和分泌水平;采用Western blotting法检测dHL-60细胞活化后LRG1、ROCK1的蛋白表达;使用重组蛋白LRG1和ROCK1抑制剂Y-27632处理dHL-60细胞,qPCR检测ROCK1和炎性因子的转录水平。结果 在LPS刺激下,中性粒细胞活化,LRG1、ROCK1表达水平显著增加,伴随炎性因子转录水平明显升高;使用重组蛋白LRG1体外刺激dHL-60细胞,ROCK1及炎性因子的转录显著上调;使用ROCK1抑制剂Y-27632,炎性因子水平显著降低。结论 LPS可激活LRG1/ROCK1信号轴促进中性粒细胞炎性因子的生成,加剧炎症反应。

针刺人迎穴调控RhoA/ROCK1通路改善自发性高血压大鼠血压及血管损伤的机制研究

[目的]基于RhoA/ROCK1通路探讨针刺人迎穴对自发性高血压大鼠血压及血管损伤的作用机制。[方法]11周龄雄性自发性高血压大鼠,随机分为模型组、针刺组和西药组,选取同周龄雄性Wistar大鼠作为正常组。针刺组和西药组分别给予针刺人迎穴和厄贝沙坦灌胃给药。观察大鼠血压变化情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和ROCK1的表达水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测内皮素-1(ET-1)和人血小板衍化生长因子-AA(PDGF-AA)的mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测颈动脉组织中基质金属蛋白酶2(MMP2)和RhoA的定位及表达水平。[结果]1)与模型组比较,西药组和针刺组在治疗3周,治疗6周时的平均动脉压有降低(P<0.05)。2)与模型组比较,西药组和针刺组在治疗6周时ET-1和PDGF-AA的mRNA和蛋白的表达均降低(P<0.05)。3)与模型组比较,西药组和针刺组在治疗6周时RhoA、AngⅡ和ROCK1的蛋白表达均降低(P<0.05),针刺组在治疗6周时MMP2的蛋白表达降低(P<0.05)。4)与西药组比较,针刺组在治疗6周时AngⅡ和ROCK1的蛋白表达均降低(P<0.05)。[结论]针刺人迎穴可能通过下调颈动脉RhoA/ROCK1通路来改善自发性高血压大鼠血压及血管损伤。

麦冬皂苷B调节Rho A/ROCK1信号通路对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的抑制作用

目的 探讨麦冬皂苷B(ophiopogonin B,OP-B)对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的影响及其作用机制。方法 将66只体质量为180~200 g的6周龄SPF级SD大鼠(雌雄各半)按随机数字表法分为模型组,OP-B低、中、高剂量组,激活剂组,每组10只。采用原位移植Walker-256肿瘤组织建立胃荷瘤模型,OP-B低、中、高剂量组大鼠分别灌胃17.5、35、70 mg/kg的OP-B并腹腔注射等量生理盐水,激活剂组灌胃70 mg/kg的OP-B并腹腔注射1 mg/kg的Rho A/ROCK1信号通路激活剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA),模型组灌胃和腹腔注射等量的生理盐水;记录移植瘤质量及体积,计算抑瘤率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肿瘤组织形态;原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)染色检测肿瘤组织细胞凋亡;免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞核增殖抗原67(proliferating cell nuclear antigen, Ki-67)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Cleaved Caspase-3)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测Ras同源基因家族蛋白A(Ras homologous gene family member A,Rho A)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase1,ROCK1)的表达;Western blot检测Rho A、ROCK1蛋白表达。结果 与模型组比较,OP-B低、中、高剂量组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著降低,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著升高(P<0.05);与OP-B高剂量组比较,激活剂组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著升高,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著降低(P<0.05)。结论 OP-B可能通过抑制Rho A/ROCK1信号通路的激活,抑制胃荷瘤大鼠肿瘤生长。

雷公藤多苷片对糖尿病肾病大鼠肾组织RhoA/ROCK1表达的影响

目的探讨雷公藤多苷片(TW)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织RhoA/ROCK1表达的影响。方法SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、TW组。空白组和模型组灌服生理盐水,TW组给予TW片。8周后测体质量、肾质量、肥大指数及肾小球体积;生化检测24 h尿蛋白、血清白蛋白(ALB)、血脂(TC、TG)、空腹血糖(FBG)等;过碘酸-雪夫氏(PAS)染色观察肾脏病理;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肾组织RhoA、ROCK1的浓度值。结果模型组ALB减少,体质量、肥大指数、TG、TC及FBG升高,肾小球体积增大,RhoA、ROCK1的表达增多,与空白组比较(P<0.05或P<0.01),具有统计学差异,说明造模成功。TW干预后,RhoA、ROCK1的表达下调,24 h尿蛋白减少,ALB升高,血脂、血糖及肥大指数降低,肾小球直径缩小,大鼠体质量及肾脏病理改善,足细胞损害减轻与模型组比较(P<0.05或P<0.01),具有统计学意义。结论TW可能通过影响DN大鼠肾组织RhoA、ROCK1的表达,而改善上述生化指标,减轻肾脏病理损害,且对肝、肾功能未见明显损害。

欧前胡素对人前列腺癌PC3细胞增殖凋亡及RhoA/ROCK1信号通路的影响

目的:探讨欧前胡素对人前列腺癌PC3细胞增殖、凋亡及Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法:设PC3细胞组、5-氟尿嘧啶组(100μg/mL)、欧前胡素低、高剂量组(60μg/mL、120μg/mL),以上各组每孔设6个平行样,培养72h。噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,Transwell腔室系统测定细胞侵袭迁移水平,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法及蛋白免疫印迹法测定细胞RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白水平。结果:与PC3细胞组比较,5-氟尿嘧啶组、欧前胡素低、高剂量组OD值、存活率、穿膜数、RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表达水平降低,凋亡率升高(P<0.05);与5-氟尿嘧啶组比较,欧前胡素低、高剂量组OD值、存活率、穿膜数、RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表达水平升高,凋亡率降低(P<0.05);与欧前胡素低剂量组比较,欧前胡素高剂量组OD值、存活率、穿膜数、RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表达水平降低,凋亡率升高(P<0.05)。结论:欧前胡素能明显抑制人前列腺癌PC3细胞增殖、侵袭迁移,促进其凋亡,其机制可能与欧前胡素抑制人前列腺癌PC3细胞RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表达进而抑制RhoA/ROCK1信号通路的激活有关。

miR-153-3p靶向下调Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)基因抑制乳腺癌细胞增殖及迁移

目的探究miR-153-3p调节乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法利用生物信息学软件检索预测miR-153-3p的候选靶基因;采用双荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与候选基因的靶向关系;应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测miR-153-3p对MDA-MB-231细胞mRNA和蛋白质表达水平的影响;通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,并以TranswellTM检测细胞的迁移和侵袭能力。结果软件预测显示miR-153-3p与Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)有连续的结合区域;共转染miR-153-3p模拟物(miR-153-3p mimics)与ROCK1野生型报告载体的细胞相对荧光素酶活性降低;转染hsa-miR-153-3p-mimics后,MDA-MB-231细胞的miR-153-3p表达水平显著增高,且ROCK1蛋白的表达量明显降低。与对照组相比,转染组MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱。结论miR-153-3p通过靶向下调ROCK1的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

益肾活血方联合缬沙坦对糖尿病肾病大鼠肾组织RhoA/ROCK1表达的影响

目的:探讨益肾活血方联合缬沙坦对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织Rho/Rho激酶表达的影响。方法:SD雄性大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、缬沙坦组、高剂量中药加缬沙坦组和低剂量中药加缬沙坦组。成模后空白组和模型组灌服生理盐水,缬沙坦组给予缬沙坦,高、低剂量中药加缬沙坦组分别按成人用药量的12.5倍、6.25倍给予中药,同时给予缬沙坦。8周后检测24 h尿蛋白、血清白蛋白(ALB)等指标,过碘酸-雪夫氏(PAS)染色观察肾脏病理,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肾组织Rho A、ROCK1的浓度值。结果:中药干预后尿蛋白明显减少,ALB升高,Rho A、ROCK1表达下调,肾脏病理改善。结论:益肾活血方可能通过影响DN大鼠肾Rho A、ROCK1的表达而发挥上述治疗作用。

隔药饼灸对动脉粥样硬化易损斑块兔RhoA/ROCK1信号通路的影响

目的观察隔药饼灸对动脉粥样硬化(AS)易损斑块兔RhoA/ROCK1信号通路的影响,探讨其稳定AS易损斑块的作用机制。方法将雄性新西兰大耳白兔随机分为空白组和手术组,手术组采用高脂饲料喂养联合腹主动脉球囊损伤法建立AS易损斑块兔模型。将成模兔随机分为模型组、直接灸组、隔药饼灸组、西药组和抑制剂组,分别给予相应干预,连续8周。ELISA检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白(APO)-A、APO-B含量,HE染色观察腹主动脉血管损伤程度,Western blot检测腹主动脉组织Ras同源物基因组成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)蛋白表达,RT-PCR检测腹主动脉组织RhoA和ROCK1 mRNA表达。结果与空白组比较,模型组兔血清TC、TG、LDL-C、APO-B含量显著增加,HDL-C、APO-A含量显著减少(P<0.01);腹主动脉内膜增厚,有斑块形成,斑块内可见多处出血,纤维帽薄,管腔狭窄,管腔内可见血栓;腹主动脉组织RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,直接灸组、隔药饼灸组和西药组兔血清TC、TG、LDL-C、APO-B含量显著减少,HDL-C、APO-A含量显著增加(P<0.01,P<0.05);HE染色显示,直接灸组兔血管损伤程度未改善,隔药饼灸组和西药组兔血管中膜损伤程度稍减轻,3组均未见血栓形成,斑块稳定性较模型组增加;腹主动脉组织RhoA和ROCK1蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论隔药饼灸能稳定AS易损斑块,其机制可能与抑制RhoA/ROCK1信号通路有关。

ShRNA对大鼠心肌细胞ROCK1和ROCK2表达的沉默作用

背景:已有研究发现,ROCK1和ROCK2参与了细胞的凋亡过程,由此假设下调ROCK1和ROCK2表达能抑制心肌细胞凋亡。目的:验证ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA转染能否有效沉默大鼠心肌细胞内ROCK1和ROCK2基因的表达,并筛选沉默效率最高的shRNA。方法:以ROCK1和ROCK2为靶基因,分别构建了3个特异性shRNA重组质粒,转染这些shRNA后观察其对SD大鼠心肌细胞中ROCK1和ROCK2的沉默作用,并筛选出沉默效率最佳的shRNA。结果与结论:WesternBlot结果显示,与对照组相比,3个重组质粒ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染均能明显降低SD大鼠心肌细胞中ROCK1和ROCK2的表达(P<0.05或P<0.01),其中ROCK1-shRNA1和ROCK2-shRNA2的沉默效率最高(P<0.05),分别为(82.15±7.53)%和(89.42±5.81)%。这表明ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA转染能有效沉默大鼠心肌细胞内ROCK1和ROCK2基因的表达,并筛选出了沉默效率最高的shRNA。

罗哌卡因对脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及RhoA/ROCK1信号通路的影响

目的:探讨罗哌卡因对脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的作用及对Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法:将脑胶质瘤U251细胞分为阴性对照组、阳性对照组,罗哌卡因低、中及高剂量组。阴性对照组正常培养不进行处理,阳性对照组给予顺铂10μg/L,罗哌卡因低、中及高剂量组分别给予罗哌卡因25、50及100 mg/L。继续培养48 h后,采用四甲基噻唑蓝法、流式细胞仪、Transwell小室和划痕法检测细胞增殖率、凋亡率、细胞侵袭数和迁移距离,采用蛋白质印迹法检测细胞中RhoA、ROCK1和基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达。结果:与阴性对照组比较,阳性对照组和罗哌卡因各剂量组脑胶质瘤U251细胞增殖率降低,细胞侵袭数减少,迁移距离缩短,RhoA、ROCK1和MMP-2蛋白表达降低,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且罗哌卡因呈剂量依赖性。与阳性对照组比较,罗哌卡因各剂量组脑胶质瘤U251细胞增殖率升高,细胞侵袭数增加,迁移距离延长,RhoA、ROCK1和MMP-2蛋白表达升高,细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:罗哌卡因可以抑制脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移,促进脑胶质瘤U251细胞凋亡,其机制可能与抑制RhoA/ROCK1通路的表达有关。

MicroRNA-21靶调控NCM460细胞ROCK1基因上调occludin表达

目的:探讨微小RNA-21(micro RNA-21,miR-21)对人正常结肠上皮细胞系NCM460中紧密连接相关蛋白——闭合蛋白(occludin)表达的影响,并分析其可能的靶基因。方法:利用miR-21过表达慢病毒建立miR-21过表达NCM460细胞系,q PCR检测miR-21表达水平,Western blot检测occludin表达情况。生物信息学方法预测miR-21的靶基因,根据评分和文献检索选择相应靶基因ROCK1进行进一步研究,利用miR-21 mimic和inhibitor转染NCM460细胞,同时检测miR-21以及ROCK1的表达水平;采用双萤光素酶报告基因实验验证ROCK1是miR-21的靶基因。结果:在NCM460细胞中过表达miR-21后可上调紧密连接相关蛋白occludin的表达。生物信息学分析预测ROCK1可能为miR-21的靶基因。在NCM460细胞中过表达miR-21可下调ROCK1的m RNA和蛋白水平,抑制miR-21可上调ROCK1的m RNA和蛋白水平。萤光素酶报告基因验证ROCK1为miR-21的靶基因。结论:在NCM460细胞中,miR-21能上调肠屏障功能相关蛋白occludin的表达。ROCK1是miR-21的靶基因,miR-21可能通过靶调控ROCK1促进occludin的表达。

ROCK1,TRAF3 mRNA在耐药性癫痫患者海马组织中的表达及意义

目的:观察耐药性癫痫患者脑组织中与锌离子相关的RhoA蛋白1(Rho-associatedc,oiled-coil containing protein ki-nase 1,ROCK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子3(TNF receptor-associated factor 3,TRAF3)mRNA的表达,探讨其在耐药性癫痫发病中的作用。方法:收集耐药性癫痫患者术后的海马脑组织,首先用基因芯片进行差异基因表达的筛选,然后用RT-PCR从基因水平上进行验证,并与正常对照组进行比较。结果:基因芯片检测中发现与锌离子连接相关的基因ROCK1和TRAF3在耐药性癫痫患者中表达上调。目的基因ROCK1和TRAF3 mRNA在耐药性患者脑组织中的表达明显增加(P<0.05),变化趋势与芯片扫描结果一致。结论:与锌离子相关的基因ROCK1和TRAF3可能参与了耐药性癫痫的形成,并在耐药性癫痫的发病机制中起着一定的作用。

电针刺激对局灶性脑梗死大鼠梗死灶周围皮质ROCK1与ROCK2表达的影响

目的观察电针刺激对局灶性脑梗死大鼠神经功能及梗死灶周围皮质ROCK1和ROCK2表达的影响,初步探讨其对大脑缺血组织的保护机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针穴位组,每组10只。用改良Longa法制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,在大鼠麻醉苏醒后90min对电针穴位组大鼠进行电针刺激,每天1次,连续14d。分别在术后1、3、7、14d时对各组大鼠进行改良神经功能缺损评分(mNSS)。术后14d时,用免疫组化和蛋白质印迹法检测缺血侧大脑皮质中ROCK1、ROCK2蛋白的表达情况。结果正常组和假手术组未出现神经功能缺损表现。术后7、14d,电针穴位组mNSS评分较模型组下降(P<0.05)。免疫组化和免疫印迹结果显示,模型组ROCK1和ROCK2蛋白表达上调,电针穴位组ROCK1和ROCK2蛋白表达较模型组减少(P<0.05)。结论电针刺激促进局灶性脑梗死后大鼠神经功能恢复,可能与其下调ROCK1和ROCK2蛋白表达有关。

ROCK1在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞黏附中的作用

目的探讨ROCK1在地塞米松(dexamethasone,Dex)抑制中性粒细胞释放和单核细胞黏附中的作用。方法检测地塞米松和法舒地尔(Fasudil,Fas)抑制佛波脂(PMA)诱导的中性粒细胞释放超氧化物阴离子(O2-)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)以及U937单核细胞黏附的程度,并检测ROCK1和RhoA的表达和活性改变。此外观察糖皮质激素受体拮抗剂——米非司酮(mifepristone,M)和蛋白质合成抑制剂——放线菌酮(cycloheximide,C)对地塞米松这些作用的影响。实验分组:对照组、PMA组、PMA+Dex组、PMA+Dex+M组、PMA+Dex+C组和PMA+Fas组。结果地塞米松可以显著抑制中性粒细胞释放O2-和MPO[(1.25±0.10)vs(1.95±0.10);(1.07±0.06)vs(1.75±0.08),P<0.05],而法舒地尔对其无明显抑制作用(P>0.05)。地塞米松和法舒地尔均可抑制U937细胞黏附[(0.09±0.01)vs(0.08±0.01)vs(0.28±0.06),P<0.05]。米非司酮和放线菌酮并不能影响地塞米松的这些作用(P>0.05)。结论地塞米松以非ROCK1依赖方式抑制中性粒细胞释放;以ROCK1依赖方式通过非基因组效应抑制U937单核细胞的黏附。

DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制小鼠肾小球内皮细胞转分化和肾纤维化

目的 基于分化型胚胎软骨发育基因2(DEC2)通过转化生长因子β/Rho相关激酶1(TGF-β/ROCK1)信号通路探讨对肾小球内皮细胞转分化的保护机制。方法 将小鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,每组6只。除假手术组外,其余组建立UUO模型。空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,于第0天(UUO后立即)在超声系统的引导下每侧肾脏注射10μL(108个嗜菌斑形成单位[PFU])空载体或DEC2载体。术后14 d处死小鼠,HE染色检测肾组织学病变情况、 Masson染色检测肾纤维化情况,Western blot法检测肾组织DEC2、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、 Rho相关激酶1(ROCK1)的蛋白表达。正常人肾小球内皮细胞(GEnC),采用ROCK1抑制剂Y-27632处理或转染DEC2, Western blot法检测暴露于TGF-β的GEnC中ROCK1、 α-SMA、 DEC2、 E-cadherin表达影响。通过免疫荧光细胞化学染色检测GEnC中ROCK1和DEC2定位,并通过免疫共沉淀实验验证二者的相互作用关系。结果 与假手术组相比,UUO组在第14天出现显著的肾纤维化和胶原蛋白积聚。在UUO组中,小鼠肾组织中DEC2和E-cadherin的表达显著降低,α-SMA的表达显著增加。与空载体处理的UUO组相比,过表达DEC2的UUO组小鼠肾纤维化和胶原蛋白积聚程度降低,并且小鼠肾组织中ROCK1、 α-SMA表达降低和DEC2、 E-cadherin表达增加。TGF-β以时间依赖性方式增强GEnC中ROCK1和α-SMA表达,并且DEC2、 E-cadherin水平降低。用ROCK1抑制剂Y-27632处理可部分消除TGF-β诱导的ROCK1、 α-SMA表达增加和DEC2、 E-cadherin表达降低。此外,在TGF-β刺激前,将GEnC转染DEC2降低细胞中ROCK1、 α-SMA表达,并增加DEC2、 E-cadherin表达。免疫荧光染色显示DEC2在GEnC中与ROCK1共定位,并且免疫共沉淀结果显示DEC2与ROCK1相互拉低。结论 DEC2在纤维化肾组织中下调,上调DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制GEnC的上皮肌纤维母细胞转分化及肾纤维化。

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1(Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase1,ROCK1)的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065bp的开放阅读框(ORF),编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪(P<0.01),出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异(P>0.05)。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞Rac1-Pak1／Rock1通路的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞Rac1-Pak1/Rock1通路分子的影响。方法 30 mg·L-1DADS分别处理MGC803细胞不同时间后,采用RT-PCR、Western blot分别检测Rac1、Pak1、Rock1、cofilin1和destrin的mRNA和蛋白水平。结果 DADS可下调MGC803细胞Rac1、Pak1和Rock1 mRNA和蛋白水平(P<0.05),对cofilin1和destrin的表达无影响,但可抑制cofilin1磷酸化(P<0.01)。结论 DADS可下调Rac1、Pak1和Rock1表达和磷酸化cofilin1;DADS抑制Rac1-Pak1/Rock1通路可能与DADS抗人胃癌MGC803细胞迁移侵袭作用机制有关。

一贯煎联合骨髓间充质干细胞调控RhoA/ROCK1通路抑制大鼠肝纤维化的实验研究

目的:探究一贯煎联合骨髓间充质干细胞在治疗肝纤维化过程中对RhoA/ROCK1通路的作用。方法:将72只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组、一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、干细胞组、一贯煎+干细胞组;四氯化碳腹腔注射6周制备肝纤维化动物模型,干预4周后取材。记录大鼠阴虚表征情况;检测血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)含量;HE、Masson染色观察病理改变;实时PCR、蛋白质印迹法检测肝组织中RhoA、Rho相关激酶1(ROCK1)、α-SMA和COL-1 mRNA及蛋白表达;IHC检测α-SMA、COL-1阳性面积。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠具有明显阴虚表征,肝脏出现明显炎症浸润和纤维增生,肝组织RhoA、ROCK1、α-SMA、胶原蛋白-1(COL-1)mRNA与蛋白表达显著升高(P<0.05),α-SMA、COL-1阳性面积显著增加(P<0.05);与模型对照组比较,一贯煎高剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎低剂量组、骨髓干细胞、一贯煎+干细胞组大鼠的阴虚表征、肝脏炎症和纤维化程度减轻,RhoA、ROCK1、α-SMA和COL-1 mRNA与蛋白表达显著降低(P<0.05),α-SMA、COL-1阳性面积显著减少(P<0.05),其中一贯煎+干细胞组较一贯煎中剂量组、干细胞组效果更优(P<0.05)。结论:一贯煎与骨髓干细胞可通过调控RhoA/ROCK1通路抑制肝星状细胞活化从而发挥抗纤维化的作用,二者协同作用效果优于各自单独作用效果。