OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路调控听觉细胞肌动蛋白细胞骨架

目的:探索氧化固醇结合蛋白样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)对听觉细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响及其相关分子机制。方法:采用OSBPL2基因敲除(Osbpl2-KO)HEI-OC1细胞探讨OSBPL2缺陷对听觉细胞肌动蛋白细胞骨架形态和功能的影响;扫描电镜观察Osbpl2-KO小鼠毛细胞静纤毛形态;Western blot实验检测HEI-OC1细胞和耳蜗内Rho/ROCK信号通路关键效应因子Rho激酶2(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 2,ROCK2)、Lim激酶1(LIM domain kinase 1,LIMK1)、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白1(actin depolymerizing factor/cofilin 1,ADF/CFL-1)的表达水平。结果:Osbpl2-KO HEI-OC1细胞微丝骨架中纤维肌动蛋白(F-actin)的分布明显减少,细胞外周微刺突和丝状伪足明显减少,细胞迁移能力明显减弱;扫描电镜下观察发现Osbpl2敲除导致小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛变短且排列紊乱;Western blot检测结果表明,在HEI-OC1细胞和小鼠耳蜗中OSBPL2-KO均导致RhoA/ROCK2信号通路的抑制。结论:在听觉细胞中OSBPL2介导的RhoA/ROCK2信号通路在维持肌动蛋白细胞骨架形态和功能的过程中发挥重要的调控作用。

溶血磷脂酸调控RhoA/ROCK2信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响

目的探讨溶血磷脂酸(LPA)与RhoA/ROCK2信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法以不同浓度LPA干预乳腺癌MDA-MB-231细胞,每隔24 h以细胞计数法观察和记录细胞的增殖。以最佳LPA促增殖浓度作用于MDA-MB-231细胞,观察Rho激酶抑制剂(Y-27632)对癌细胞的影响;以Pull-down及Western blot法检测各组细胞内RhoA活性及RhoA、ROCK2蛋白表达。结果 LPA以时间及剂量依赖性关系显著促进MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.05);Y-27632可以显著抑制LPA的促增殖作用;LPA干预后RhoA活性及RhoA、ROCK2蛋白表达显著升高(P<0.05),Y-27632干预后RhoA活性及RhoA、ROCK2蛋白表达显著下降(P<0.05)。结论 LPA可能通过调控RhoA/ROCK2信号通路促进乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌的临床治疗提供了新思路。

溶血磷脂酸调控RhoA/ROCK2信号通路对大鼠脑缺血再灌注后的影响

目的分析溶血磷脂酸(LPA)调控RhoA/ROCK2信号通路对脑缺血再灌注后的影响。方法使用线栓法成功构建20只脑动脉栓塞大鼠,缺血2 h后再行灌注,灌注24 h后完成脑缺血再灌注模型,将其按照随机数字表法分为两组,每组各10只,分别为模型组和LPA组。LPA组每日腹腔注射50μmol/L的LPA,模型组每日腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液,同时随机纳入10只健康大鼠作为对照组,各组均标准饲养14 d。比较各组大鼠脑神经细胞活力、迁移、凋亡情况,并比较各组大鼠14 d后脑神经细胞炎症因子[白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平、细胞内RhoA、ROCK2蛋白和mRNA表达情况。结果标准饲养7 d和14 d后,模型组大鼠的脑神经细胞活力和迁移个数均低于对照组,LPA组大鼠的脑神经细胞活力和迁移个数均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05);且标准饲养14 d后,LPA组大鼠的脑神经细胞活力和迁移个数高于7 d时,而模型组大鼠14 d的脑神经细胞活力和迁移个数低于7 d时,差异均有统计学意义(P<0.05)。标准饲养7 d和14 d后,模型组大鼠的脑神经细胞凋亡率均高于对照组,LPA组大鼠的脑神经细胞凋亡率低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05);标准饲养14 d后,LPA组大鼠的脑神经细胞凋亡率低于7 d,而模型组大鼠14 d的脑神经细胞凋亡率高于7 d时,差异均有统计学意义(P<0.05)。标准饲养14 d后,模型组大鼠的脑神经细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于对照组,LPA组大鼠的脑神经细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。标准饲养14 d后,模型组大鼠的脑神经细胞内RhoA、ROCK2蛋白和mRNA均低于对照组,LPA组大鼠的脑神经细胞内RhoA、ROCK2蛋白和mRNA均高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论LPA可通过调控RhoA/ROCK2信号通路提高脑神经细胞活性,促进迁移,抑制凋亡,缓解炎症反应。

异丙酚诱发新生大鼠海马神经元凋亡及与RhoA/ROCK2信号通路的关系

目的探讨异丙酚诱发的新生大鼠海马神经元凋亡情况及其与RhoA/ROCK2信号通路的关系。方法 46只SD大鼠随机分为对照组,低、高剂量实验组,分别腹腔注射脂肪乳剂7. 5 mL·kg^(-1),异丙酚50 mg·kg^(-1),异丙酚100mg·kg^(-1)。分离并培养新生SD大鼠神经元,对照组(C组)神经元正常培养,低、高剂量异丙酚干预组(P组)神经元分别加入6,12μg·mL^(-1)异丙酚。用TUNEL法检测原代SD大鼠神经元凋亡情况,蛋白免疫印迹法检测大鼠海马组织中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及RhoA/ROCK2信号通路蛋白的表达。结果 C组,低、高剂量P组凋亡率分别为(9. 54±1. 13)%,(10. 53±1. 85)%,(27. 63±2. 54)%,高剂量异丙酚干预组分别与对照组和低剂量试验组比较,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。对照组,低剂量实验组和高剂量实验组海马组织中Caspase-3蛋白相对表达量分别为0. 28±0. 03,0. 32±0. 05,0. 98±0. 25; RhoA蛋白相对表达量分别为0. 25±0. 05,0. 32±0. 06,0. 87±0. 08;ROCK2蛋白相对表达量分别为0. 59±0. 11,0. 63±0. 20,1. 53±0. 09,高剂量实验组分别与对照组和低剂量试验组比较,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论高剂量异丙酚可诱发新生大鼠海马神经元凋亡,且RhoA/ROCK2信号通路的激活参与了该过程。

抗纤益心方通过调节RhoA/ROCK2信号通路改善扩张型心肌病大鼠心肌纤维化

目的:探讨抗纤益心方抑制扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)模型大鼠心肌纤维化的相关分子机制。方法:80只Wistar雄性大鼠随机分为正常组(10只)和造模组(70只)。采用呋喃唑酮自饮水法建立DCM大鼠模型,将造模成功大鼠(45只)随机分为模型组、卡托普利(10.125 mg·kg^(-1))组及抗纤益心方高(3.6 g·kg^(-1))、中(1.8 g·kg^(-1))、低剂量(0.9 g·kg^(-1))组。连续药物干预4周后超声心动图检测各组大鼠心脏功能;HE染色和Masson染色检测心肌组织病理改变;ELISA检测血清中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(soluble growth stimulating factor 2,sST2)及半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)的含量;Western Blot检测Ras同源蛋白家族成员A(ras homologous family member A,RhoA)、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(rho associated coiled coil forming protein kinase 2,ROCK2)、肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)、p-MYPT1的蛋白表达水平。结果:与正常组相比,模型组大鼠LVEDD、LVESD显著升高(P<0.01),LVEF、LVFS显著降低(P<0.01),心肌组织胶原蛋白过度沉积,CVF及sST2和Gal-3含量显著升高(P<0.01),心肌组织RhoA、ROCK2、p-MYPT1蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,抗纤益心方高、中剂量组和卡托普利组大鼠LVEDD、LVESD显著降低(P<0.05),LVEF、LVFS显著升高(P<0.05),心肌组织病理明显改善,胶原蛋白沉积明显改善,心肌纤维化明显减轻,CVF及血清sST2和Gal-3含量显著降低(P<0.05),心肌组织RhoA、ROCK2、p-MYPT1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:抗纤益心方可能通过下调RhoA/ROCK2信号通路抑制DCM大鼠心肌纤维化的发生。

LPA对子宫颈癌干细胞生物学特性的影响及对RhoA/Rock2通路调控作用

目的:研究和探讨溶血磷酸酯(lysophosphatidic acid,LPA)对子宫颈癌干细胞生物学特性的影响及对RhoA/Rock2通路的调控作用,进一步明确宫颈癌的发病机制,并为将来研制宫颈癌靶点药物提供理论依据。方法:以宫颈癌Siha细胞株为原代细胞,球囊培养富集宫颈癌干细胞,观察细胞的克隆形成能力,检测细胞表面标志物。成功培养子宫颈癌干细胞,分为对照组、LPA组及抑制组,对照组正常培养,LPA组分别加入不同浓度(1、5、10、15、20umoL/L)的LPA,抑制剂组以最佳促增殖浓度的LPA细胞组为基础,加入Rho激酶抑制剂Y-27632,观察细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线图,采用PCR法检测各组细胞LPA、RhoA、Rock2的mRNA水平,western blot法检测RhoA及Rock2的表达情况。结果:经培养后有悬浮细胞球形成,细胞表型为CD44^+、CK17^+、CD34^-、CD105^-,成功获得子宫颈癌干细胞,加入LPA后,对癌细胞增殖有显著的促进作用,且存在时间与剂量依赖性关系(P<0.05),加入Y-27632后对细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.05),LPA组的LPA、RhoA、Rock2的mRNA水平及RhoA、Rock2蛋白表达量均显著高于对照组与抑制组(P<0.05)。结论:LPA可以促进子宫颈癌干细胞的增殖,其作用机制可能是通过调控RhoA/Rock2通路来实现的。

亚甲蓝对阿尔茨海默症大鼠认知功能障碍及RhoA/ROCK2通路的影响

目的探究亚甲蓝对阿尔茨海默症(AD)大鼠神经系统的保护作用,以及对RhoA/ROCK2信号通路的影响。方法50只Wistar大鼠随机数表法分成空白对照组、模型组、亚甲蓝低剂量组、亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐(阳性对照)组,每组10只。除空白对照组外,其余各组大鼠均双侧脑室注射β淀粉样蛋白(Aβ)诱导AD模型。Morris水迷宫检测大鼠认知能力;试剂盒检测大鼠血清中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平;乙酰胆碱酯酶(Ache)比色法检测大鼠海马组织中Ache活性;ELISA试剂盒检测大鼠海马组织匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察海马组织形态学变化;TUNEL染色观察海马神经细胞凋亡;Western blot检测大鼠海马组织中RhoA、ROCK2蛋白表达水平。结果空白对照组大鼠海马组织结构正常,无明显的神经细胞变性和损伤。模型组大鼠神经细胞排列疏松,数量减少,形态不规则。与模型组相比,亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠海马组织中细胞排列较为紧密有序,细胞数量增加,核仁较为清晰。与空白对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期、细胞凋亡率、MDA活性、Ache活性、TNF-α和IL-1β水平及RhoA、ROCK2蛋白表达水平显著升高,跨平台次数和目标象限内游泳时间、血清中SOD水平显著降低,差异有统计学意义,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,亚甲蓝低、高剂量组和多奈哌齐组大鼠逃避潜伏期、细胞凋亡率、MDA活性、Ache活性、TNF-α和IL-1β水平及RhoA、ROCK2蛋白表达水平显著降低,跨平台次数和目标象限内游泳时间、血清中SOD水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,亚甲蓝高剂量组和多奈哌齐组大鼠各项指标检测结果的差异无统计学意义(P>0.05)。结论亚甲蓝可抑制AD大鼠神经炎症和氧化应激反应,改善认知功能,其作用机制可能与抑制RhoA/ROCK2信号通路有关。

温肺降浊方联合ROCK2-shRNA转染对血管性痴呆大鼠的神经保护作用

目的基于ROCK2-shRNA转染技术,探讨温肺降浊方对血管性痴呆大鼠学习、记忆能力及海马组织病理形态的影响。方法将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组、ROCK2干扰组、阴性对照组、中药+ROCK2干扰组,每组10只。除假手术组外,其余组均采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备血管性痴呆模型。造模成功后,ROCK2干扰组及中药+ROCK2干扰组将AAV9-ROCK2-shRNA注射至大鼠海马组织,ROCK2干扰组同时给予生理盐水灌胃4周,中药+ROCK2干扰组同时给予温肺降浊方2 g/(kg·d)灌胃4周;阴性对照组同法注射空载体腺相关病毒,同时给予生理盐水灌胃4周;中药组给予温肺降浊方2 g/(kg·d)灌胃4周,假手术组、模型组给予生理盐水灌胃4周。分别于术后1周及4周,采用Morris水迷宫测试大鼠学习、记忆能力;术后4周处死各组大鼠,电镜观察海马神经元突触超微结构,尼氏染色法观察海马组织中神经元的分布、形态及尼氏小体数量,Tunel染色检测海马神经元凋亡情况。结果术后1周,模型组与各干预组大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);术后4周,与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.05),穿越平台次数明显减少(P<0.05);与模型组比较,中药组、ROCK2干扰组及中药+ROCK2干扰组大鼠逃避潜伏期均明显缩短(P均<0.05),跨越平台次数均明显增加(P均<0.05);与ROCK2组及中药组比较,中药+ROCK2干扰组大鼠逃避潜伏期更短(P均<0.05),穿越平台次数更多(P均<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠神经元分布散乱,突触形态紊乱,细胞器破裂消失,尼氏小体数目明显减少(P<0.05),海马神经元细胞凋亡数明显增加(P<0.05);与模型组比较,中药组、ROCK2干扰组及中药+ROCK2干扰组大鼠神经元损伤明显改善,海马神经元突触形态及细胞器结构较完整规则,尼氏小体数量明显增加(P均<0.05),海马神经元细胞凋亡数明显减少(P均<0.05);与ROCK2组及中药组比较,中药+ROCK2干扰组大鼠神经元突触形态更规则、细胞器更完整,且尼氏小体数目明显增多(P均<0.05),海马神经元细胞凋亡数明显减少(P均<0.05);中药组与ROCK2干扰组各观察指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论温肺降浊方能明显改善血管性痴呆大鼠的学习与记忆能力,机制可能与其能降低ROCK2表达,进而抑制RhoA/ROCK2信号通路的传导,改善海马神经元结构损伤,减少神经细胞凋亡有关。

侯氏黑散中风药、补虚药对脑缺血大鼠轴突生长抑制信号通路Nogo-A/NgR与RhoA/Rock2的影响

目的探讨侯氏黑散方中风药、补虚药以及风药补虚药联用对脑缺血大鼠轴突生长抑制因子Nogo-A、NgR、Rho A、Rock2蛋白表达的影响。方法采取线栓法制备永久性大脑中动脉栓塞(p MACO)模型。大鼠随机分为假手术组、模型组、风药组(7.70 g/kg)、补虚药组(2.59 g/kg)、风药补虚药联用组(10.50 g/kg)。术后每12 h灌胃给药1次,连续给药72 h。运用Western blot检测大鼠缺血侧海马CA1区Nogo-A、NgR、Rho A、Rock2蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠Nogo-A、NgR、Rho A、Rock2蛋白的表达均升高(P<0.01);与模型组相比,各给药组大鼠NgR的蛋白表达均显著下降(P<0.01);Rho A、Rock2蛋白的表达均不同程度的下降,但只有联用药组具有统计学差异(P<0.05)。结论侯氏黑散中风药、补虚药可能通过对脑缺血大鼠轴突生长抑制信号通路Nogo-A/Rho A/Rock2的调节促进脑缺血后神经功能的修复。

木犀草素减轻糖尿病小鼠心肌损伤及其机制

目的探讨木犀草素(Luteolin,LTL)对糖尿病小鼠心肌损伤影响及其可能调控机制。方法腹腔注射链脲霉素制备1型糖尿病小鼠模型,将雄性C57/BL6J小鼠分为3组(每组16只):对照组,糖尿病组,糖尿病+木犀草素组。糖尿病+木犀草素组给予LTL 50 mg/(kg·d)灌胃,对照组和糖尿病组给予50 g/L的羧甲基纤维素钠灌胃。药物治疗3月后,小鼠心脏超声检测心功能;Masson评估胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF);Tunel法检测心肌细胞凋亡;Western blot检测Rho和ROCK2的表达。结果与对照组相比,糖尿病组各项心功能指标显著降低(P<0.05),CVF显著增高(P<0.05),小鼠心肌细胞凋亡显著增高(P<0.05),Rho和ROCK2的表达显著增加(P<0.05);与糖尿病组相比,糖尿病+木犀草素组各项心功能指标明显改善(P<0.05),CVF显著降低(P<0.05),小鼠心肌细胞凋亡显著降低(P<0.05),Rho和ROCK2的表达降低(P<0.05)。结论 LTL可能通过抑制RhoA/ROCK2信号通路减少糖尿病小鼠心肌细胞凋亡,从而减轻糖尿病心肌损伤。

法舒地尔减轻新生大鼠脑室周围白质软化的作用机制研究

目的:使用法舒地尔(10 mg/kg)干预缺氧缺血诱导的脑室周围白质软化(periventricular leukomala⁃cia,PVL)新生大鼠模型,探讨法舒地尔是否对大鼠PVL具有治疗作用及其机制。方法:建立缺氧缺血诱导的3日龄新生大鼠PVL模型。将225只3日龄SD大鼠乳鼠,随机分为假手术组、PVL+生理盐水组(PVL组)和PVL+法舒地尔组。每组分为12 h、24 h、48 h、72 h和30 d时点亚组,每个亚组样本量为15只。72 h后取脑组织,制作石蜡切片,HE染色观察脑组织的病理改变;使用RT-qPCR法测ROCK2的mRNA表达水平;Western blot检测ROCK2和NF-κB P65的表达。神经行为学检测和评定于30 d后进行。结果:(1)造模后12、24和48 h PVL组及PVL+法舒地尔组大鼠体重增长速率显著落后于假手术组(P<0.05);(2)HE染色可见假手术组大鼠左右脑室正常,PVL组和PVL+法舒地尔组出现病理形态学变化,而PVL+法舒地尔组相对于PVL组病理改变较轻;(3)PVL组和PVL+法舒地尔组ROCK2的mRNA及蛋白表达较假手术组显著上调(P<0.05);(4)PVL组NF-κB P65的表达在24和48 h较PVL+法舒地尔组和假手术组显著上调(P<0.05)。结论:法舒地尔能够减轻PVL新生大鼠脑部病理损伤,改善远期神经功能,其机制可能与抑制ROCK通路、减少NF-κB P65活化从而减轻炎症损伤有关。

丙泊酚预处理对大鼠脑缺血再灌注线粒体凋亡的影响及可能机制

目的探讨丙泊酚预处理对大鼠脑缺血再灌注线粒体凋亡的影响及可能机制。方法30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、局灶性脑缺血-再灌注大鼠模型组(CIRI组)和丙泊酚预处理组(P组)。再灌注24h后实行神经功能缺陷评分;HE染色观察脑组织损伤情况;免疫荧光检测观察MAP-2表达;TUNEL染色观察脑组织细胞凋亡情况;Western blot检测脑组织AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3以及RhoA/ROCK2信号通路蛋白表达水平。结果与Sham组比较,CIRI组和P组神经功能缺陷评分明显升高,脑损伤严重,MAP-2表达降低(P<0.05),细胞凋亡率升高,脑组织中AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3,RhoA和ROCK2蛋白的表达水平均升高(P<0.05)。而与CIRI组比较,P组神经功能缺陷评分明显降低,并且脑损伤程度降低,MAP-2表达升高(P<0.05),细胞凋亡率降低,脑组织中AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、RhoA和ROCK2蛋白表达降低(P<0.05)。结论丙泊酚通过抑制RhoA/ROCK信号通路,对大鼠脑缺血再灌注的神经功能损伤和线粒体凋亡起到改善作用。