农杆菌介导rolC基因转化烟草植株的研究

通过根癌农杆菌介导手段 ,将来自发根农杆菌的rolC基因转化到烟草 (Nicotianatabacum )植株的基因组 ,并借助GUS组织化学法 ,PCR扩增法和Southern杂交进行了鉴定证实。rolC基因改变转基因烟草植株某些性状的特点 ,如植株高度变矮、花冠变小、雄蕊变短等 。

超声波辅助农杆菌介导八棱海棠转rolC基因

应用超声波辅助农杆菌介导法,对八棱海棠进行rolC基因转化,以期提高转化效率并获得转基因植株。利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理时期和农杆菌悬浮液中乙酰丁香酮(As)浓度对rolC基因转化率的影响。结果表明,叶盘在D600nm为0．6且含有75 mg／L As的农杆菌悬浮液中侵染2 min后,用功率为100 W的超声波处理30 s,再浸泡2．5 min,然后放到再生培养基上共培养3 d,能获得最佳的gus基因瞬间表达率。最佳处理条件下转化683枚八棱海棠叶片,共得到138个抗性愈伤组织和15株抗性苗,转化率为2．2％。GUS染色、PCR及Southern blotting检测结果显示,有12个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因。

rolC基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的遗传转化

通过对Ri质粒转化三倍体毛白杨植株转入rolC基因,使外源基因rolC在植物体内形成多拷贝,从而对rolC基因表达产生干扰,而减少Ri质粒转化三倍体毛白杨造成的不良形态变异。本研究建立了转Ri质粒三倍体毛白杨的叶片再生体系,筛选出叶片再生的最佳培养基为:MS+6-BA 1.0 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1;确定了卡那霉素(Km)和抑菌抗生素头孢噻肟钠(CTX)的临界浓度为30 mg.L-1和400 mg.L-1;采用农杆菌介导的叶盘法,将rolC基因转入经发根农杆菌Ri质粒30148转化的三倍体毛白杨植株中,获得了18个Km抗性系,对其中14个株系进行了PCR检测,表明rolC基因已整合进再生植株中。与转Ri质粒三倍体毛白杨和未转基因三倍体毛白杨相比,部分转Ri质粒三倍体毛白杨在转rolC基因后发生了形态特征变异,比如部分无性系的叶片由原来的皱缩变为平展,部分无性系的茎由原来的直立变为弯曲,侧枝增多,节间距明显缩短。

转rolC基因八棱海棠组培苗生物学特性的研究

目的通过研究转rolC基因八棱海棠不同株系的转基因拷贝数,在转录水平上的表达丰度,以及转基因组培苗的生物学特性,为进一步深入阐明rolC基因在八棱海棠中的表达机制和培育优良的苹果砧木奠定理论基础。方法以通过gus染色和PCR检测的3个转rolC基因八棱海棠株系组培苗为试材。Southern杂交鉴定rolC基因整合拷贝数。Northern杂交鉴定rolC基因在转录水平上的表达丰度。调查转基因植株组培苗在含有不同种类和浓度的植物生长调节剂的培养基上茎段增殖、叶片再生、生根能力等生物学特性;将生根后的组培苗进行炼苗,移入温室4个月后,研究株高、节间数、节间长度、叶面积等生物学特性。结果Southern杂交结果表明,rolC基因分别整合进入3个八棱海棠株系基因组,其中株系20a和33a分别获得了1个rolC基因拷贝,株系20b获得了2个rolC基因拷贝。Northern杂交结果表明,3个转基因株系中的rolC基因均在转录水平上得到了表达,且该基因在单拷贝株系的表达丰度高于双拷贝株系。转基因组培苗生物学特性研究结果表明:(1)3个转rolC基因八棱海棠株系茎段增殖系数、叶片再生率、生根所需外源激素浓度均显著低于对照植株,单拷贝株系的以上指标亦显著低于双拷贝株系。(2)3个转基因八棱海棠株系组培苗平均生根数显著高于转基因株系,双拷贝株系显著低于单拷贝株系;根长情况正好相反;对照植株根粗和转基因株系根粗之间均无显著差异。(3)3个转基因八棱海棠株系的株高、节间长度、节间数、叶面积均显著小于对照植株。其中单拷贝株系显著小于双拷贝株系。结论rolC基因整合进入3个八棱海棠转基因株系基因组,并分别在转录水平上得到表达。外源rolC基因的表达导致转基因植株体内内源激素含量和植株形态学的改变,且rolC基因的整合拷贝数对它的表达有一定的影响。

发根农杆菌rolC基因的克隆及序列分析

以发根农杆菌30148为材料,设计了rolC基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增出了正确序列的rolC基因585 bp片段,并利用pUCm-T载体对此片段进行了克隆,并进行了序列分析。所克隆rolC基因与已发表的序列相比较,核苷酸序列的同源性达到100%,但另一个克隆中部分碱基发生了改变,同源性达到99%。

Ri质粒的快速提取及rolC基因的克隆

介绍Ri质粒的快速提取方法,提取的质粒可用于目的基因的扩增,应用rolC基因的特异性引物,扩增出了正确序列的rolC基因0.87kb片段,并利用pGEM—T载体对此片段进行了克隆。

rolC基因对颠茄托品烷生物碱合成的影响

发根农杆菌浸染植物后产生的发根可合成高水平次生代谢产物,这种代谢增强作用是由rol基因诱导激发的,因此可利用rol基因提高颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)的合成能力。本研究以颠茄为实验材料,将发根农杆菌pRiA4质粒上的rolC基因通过CaMV35S启动子驱动,导入颠茄中超表达。分析转基因颠茄的表型、TAs含量以及TAs合成途径关键酶基因转录表达水平表化。结果表明,转基因颠茄表现出根系发达、雄性不育、雄蕊柱长高于雌蕊、提前开花、节间缩短、花小且多、腋芽和侧芽增多、顶端优势下降和叶片狭长等表型;转基因颠茄的TAs含量均显著高于对照,莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量最高可达对照的2.58、3.59和15.77倍;TAs合成途径中的3个关键酶基因腐胺N-甲基转移酶(PMT)、托品酮还原酶I(TRⅠ)和莨菪碱6-β-羟化酶(H6H)的表达量与对照相比表达上调。以上研究表明rolC基因通过上调颠茄TAs合成关键酶基因的表达提高了颠茄中TAs的合成能力,为利用rolC基因进行高TAs含量的颠茄分子育种奠定了基础。

超声波直接转导外源基因转化八棱海棠的技术研究

应用超声波直接转导法,对八棱海棠进行rolC基因转化,同时,利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理功率和转化缓冲液中二甲基亚砜(DMSO)对rolC基因转化率的影响。结果表明:当DMSO为5%(体积分数)时,用80 W功率处理20 min,能够获得最佳的转化效果。在超声波最佳处理条件下转化486个八棱海棠叶片,共得到237个抗性愈伤组织和9株抗性苗,转化率为1.85%。GUS染色、PCR及Southern blotting检测结果显示,有8个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因。

影响人参发根中皂甙含量基因的定位及其克隆

通过发根农杆菌与人参外植体共培养 ,在人参根外植体上用直接接菌方法 ,诱导出人参发根。Southern点杂交证明 :本研究获得的人参发根确已被Ri质粒的T DNA所转化 ,并被整合到人参发根DNA上。根据Slightom等RiA4TL DNA序列分析结果 ,利用PCR方法从人参发根中扩增并克隆了影响人参皂甙合成基因rolC。

人参发根的诱导及其分子检测

[目的]探讨发根农杆菌诱导人参发根分子机理。[方法]用发根农杆菌A4菌株感染3年生人参根外植体,在无激素的MS培养基上诱导人参发根,并对其进行分子检测,考察rolB和rolC基因是否转化并整合到人参基因组中。[结果]成功获得了人参发根,该发根在固体和液体培养基上得到了很好的继代;从人参发根DNA中检测到rolB和rolC基因,与已发表发根农杆菌质粒相应的核苷酸序列的同源性达到99%。[结论]发根农杆菌质粒的rolB和rolC基因已转化并整合到人参基因组中,是人参发根产生的分子机理。

发根农杆菌转化新疆紫草的PCR检测及序列分析

以发根农杆菌MSU440菌株转化的新疆紫草毛状根为材料,设计了rolC基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增得到了600 bp左右的特异性核苷酸片段。进行双向测序分析,扩增的基因序列全长626 bp,含rolC基因的编码区540 bp,编码180个氨基酸组成的蛋白。正向测序rolC基因与GENEBENK已发表的序列相比较,核苷酸序列的同源性达到100%,氨基酸同源性高达100%;反向测序中,同源性达到97%。证实并确认了新疆紫草毛状根的真实性,为进一步利用新疆紫草毛状根生产次生代谢产物研究奠定了物质基础。