我国斑点热立克次体新种检测及其rOmpA基因序列分析

采用斑点热群立克次体特异引物扩增福建南部来源蜱标本和动物标本中的DNA ,以发现我国可能存在的新种斑点热群立克次体。以立氏立克次体rOmpA基因序列中的相关序列为引物 ,扩增标本中rOmpA基因部分片段 ,用pGEM -T载体及其宿主菌进行阳性克隆筛选 ,阳性克隆经鉴定之后提取质粒DNA ,进行序列测定。测定序列用Blast软件进行序列同源性比较并采集相关序列 ,用Bootstrip方法随机取样 10 0次 ,用PHYLIP软件包进行聚类分析。共检测采自福建宁化地区的越原血蜱 10 0只和野鼠类血标本 38份。其中从越原血蜱(不同来源 )扩增出斑点热立克次体基因片段 ,阳性率为15 0 4% ( 17/ 113) ;并从社鼠、黄胸鼠、褐家鼠扩增出阳性片段 ,以鼠类为单位计算其阳性率为 44 73%。对寄生于野鼠的越原血蜱扩增的阳性片段序列分析表明新测序列与其它斑点热群立克次体的同一基因片段不同 ,其与日本立克次体同源性最高 ,核苷酸序列同源性为 94% ,推定的氨基酸序列同源性为89 %。从病原学角度首次证实我国福建省存在日本立克次体近缘种立克次体 。

斑点热群立克次体中国分离株rOmpA基因片段的克隆和序列分析

用Rr190.70p-602n引物扩增了斑点热群立克次体（spottedfevergrouprickettsiae，SFGR）中国分离株（BJ－90株、Ha－91株和HLJ－054株）及SFGR国际标准株西伯利亚立克次体（Rickettsiasibiricu）246株和派克立克次体（R.parkeri）的rOmpA基因片段，将PCR产物克隆入pGEM－T载体中，用双脱氧法进行序列测定，并与SFGR的rOmpA基因已知序列进行了比较。结果表明，SFGR国际标准株间rOmpA基因片段的核苷酸同源性为90.06%～96.62%，推定氨基酸的同源性为83.05％～94.35％，中国分离株与国际标准株及参考株rOmpA基因片段比较的结果发现：BJ－90株及Ha－91株与西伯利亚立克次体标准株的核苷酸同源性分别为99．06％和98．31％，推定氨基酸的同源性则为98.87％和96.61％，HL－93株和HLJ-054株与日本立克次体（R.japonica）核苷酸同源性较高，分别为96.62％和95.68％，推定氨基酸的同源性为92．09％和89．27％。在中国分离株内，BJ-90株和Ha－91株的核昔酸同源性高达99．20％，推定氨基酸的同源性为97．74％，HIJ－054株和HL－93株rOmpA基因片段的核苷酸及推定氨基酸的同源性分别为98.12％，94.92％。因此认为在中国广阔的地域内，除HLJ-054株和HL-93株可能为SFGR的新成员外。

Habitat fragmentation, vole population fluctuations, and the ROMPA hypothesis: An experimental test using model landscapes

Increased habitat fragmentation leads to smaller size of habitat patches and to greater distance between patch­es.The ROMPA hypothesis(ratio of optimal to marginal patch area)uniquely links vole population fluctuations to the composition of the landscape.It states that as ROMPA decreases(fragmentation increases),vole popu­lation fluctuations will increase(including the tendency to display multi-annual cycles in abundance)because decreased proportions of optimal habitat result in greater population declines and longer recovery time after a harsh season.To date,only comparative observations in the field have supported the hypothesis.This paper re­ports the results of the first experimental test.I used prairie voles,Microtus ochrogaster,and mowed grassland to create model landscapes with 3 levels of ROMPA(high with 25%mowed,medium with 50%mowed and low with 75%mowed).As ROMPA decreased,distances between patches of favorable habitat(high cover)in­creased owing to a greater proportion of unfavorable(mowed)habitat.Results from the first year with intensive live trapping indicated that the preconditions for operation of the hypothesis existed(inversely density depen­dent emigration and,as ROMPA decreased,increased per capita mortality and decreased per capita movement between optimal patches).Nevertheless,contrary to the prediction of the hypothesis that populations in land­scapes with high ROMPA should have the lowest variability,5 years of trapping indicated that variability was lowest with medium ROMPA.The design of field experiments may never be perfect,but these results indicate that the ROMPA hypothesis needs further rigorous testing.

鸭疫里默氏杆菌OmpA/motb蛋白的表达纯化及免疫学特性分析

本研究对血清1型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)CH3株的ompA/motb基因核苷酸序列及其蛋白进行生物学信息分析,用PCR技术扩增获得去除信号肽编码区段的ompA/motb基因,并构建重组表达质粒pET30a-OmpA/mtob,成功表达分子量约为55 kDa的重组蛋白rOmpA/motb。Western blot结果显示,rOmpA/motb能与血清1、2、10和15型RA阳性血清发生特异性反应,表明rOmpA/motb具有交叉免疫原性。以纯化的rOmpA/motb免疫新西兰大白兔,经3次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗体效价为1:256 000;Western blot结果显示OmpA/motb兔多抗可与血清1型、2型、10型和15型RA菌株发生特异性结合反应,与其他菌株无反应性。本研究制备的RA OmpA/motb多克隆抗体具有良好的反应性及特异性,为进一步研究OmpA/motb蛋白的免疫学功能及建立鸭疫里默氏杆菌病的诊断方法奠定了基础。

斑点热群立克次体中国分离株HL-93和HLJ-054亲缘关系的研究

目的 通过斑点热群立克次体 (spottedfevergrouprickettsiae ,SFGR)rOmpA基因片段的序列分析对HL 93和HLJ 0 5 4的亲缘关系进行研究。方法 用PCR分段扩增rOmpA基因重复区后 1 9kb片段 ,PCR产物直接测序 ,用WinstarDNA分析软件包进行同源性比较、进化树分析及酶切位点的分析。 结果 HL 93株和HLJ 0 5 4株核苷酸及推定氨基酸的同源性均在 99%以上 ,在树形图上单独聚为一类。常用酶的酶切位点完全一致。结论 HL 93株和HLJ 0 5 4株为同一种SFGR ,建议均命名为黑龙江立克次体 ,但可能存在株间差异性。

我国部分地区蜱传斑点热分子流行病学调查研究

目的为进一步了解我国斑点热群立克次体存在的多样性,发现可能存在的斑点热群立克次体新成员、潜在媒介和动物宿主。方法建立了扩增斑点热群立克次体190kDa rOmpA基因片段的PCR检测、鉴定方法,并用此方法检测了采自福建省和内蒙古自治区的蜱、动物和人血液标本。对扩增于越原血蜱、森林革蜱和FNH97未鉴定菌株的PCR产物采用PHYLIP软件包进行了序列分析。同时,为了寻找特异的斑点热群立克次体分类检测方法,建立了针对四种斑点热群立克次体的半巢式PCR方法,并对斑点热立克次体阳性标本进行了分类检测。结果采用 190kDa rOmpA.701/70p引物可以从7株斑点热群立克次体中的6株扩增出外膜蛋白A基因片段(小蛛立克次体除外)。并从采自福建省和内蒙古自治区的多种蜱及野生动物、人血液标本中扩增出了斑点热立克次体DNA片段,其中越原血蜱、卵形硬蜱、中华硬蜱、豪猪血蜱、森林革蜱、野鼠血块和人群血块的阳性率分别为15.69％、56.94％、8.70％、7.70％、43.56％、82.51％和0.98％。对来自越原血蜱和森林革蜱以及FNH97菌株的斑点热立克次体190kDa外膜蛋白A630bp左右核苷酸片段序列分析和推测的氨基酸序列分析结果表明:福建越原血蜱立克次体(福建立克次体)核苷酸序列与日本立克次体的该序列同源性最高(94％)。推测氨基酸序列同源性也与该立克次体最高(89％);内蒙古森林革蜱立克次体(森林革蜱立克次体)核苷酸序列与扇头蜱立克次的该序列同源性最高(97％),推测氨基酸序列的同源性也最高(95％)。遗传发育分析,这两种立克次体分别与日本立克次体和扇头蜱立克次体均为同一个分支。序列中限制性核酸内切酶的位点也显示了对应的相似性。但是它们的核苷酸和推测的氨基酸序列与康氏立克次体和西伯利亚立克次体以及内蒙古立克次体(HA-91)差别较大。提示,这两种蜱携带的立克次体可能是我国尚未发现的斑点热群立克欢体新成员。用初步分类引物对蜱标本、血液标本检测结果显示:以“福建立克次体”序列设计的引物检测越原血蜱阳性率为8.49％,卵形硬蜱阳性率为20.83％,中华硬蜱阳性率为4.35％,豪猪血蜱为阴性;以西伯利亚立克次体序列设计的引物检测卵形硬蜱阳性率为 24.39％,越原血蜱阳性率为 5.56％,中华硬蜱和豪猪血蜱均为阴性。以内蒙革蜱立克次体序列设计的引物扩增森林革蜱阳性率为43.56％。结论通过本次研究,在以下方面获得了新的认识:越原血蜱、卵形硬蜱、豪猪血蜱和中华硬蜱是福建南方蜱传斑点热立克次体的媒介或潜在媒介,其中卵形硬蜱、豪猪血蜱和中华硬蜱为我国首次证实的携带斑点热立克次体;福建的越原血蜱和内蒙古的森林革蜱分别携带一种未知斑点热群立克次体,并分别与日本立克次体和肩头蜱立克次体近缘;取自斑点热立克次体rOmpA基因的引物用于PCR,作为一种快速简便手段可直接用于斑点热立克次体初步分类和分子流行病学调查;我国可能存在斑点热群立克次体的多个成员及其自然疫源地。

不同复性方法纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白A小鼠免疫原性研究

为探究不同复性方法制备的重组大肠杆菌外膜蛋白A(rOmpA)的免疫原性,研究分别用纯化的β-环糊精复性rOmpA(β-rOmpA)、吐温-20复性rOmpA(T-rOmpA)和包涵体形式rOmpA(I-rOmpA)作为抗原,与弗氏佐剂乳化后肌肉注射免疫接种小鼠。通过检测血清特异性抗体、脾淋巴细胞分泌细胞因子及攻毒试验进行免疫效力评价。结果,β-rOmpA免疫组小鼠血清抗体水平高于T-rOmpA免疫组和I-rOmpA免疫组(P<0.05);三种抗原免疫均能提高小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平,且在体外由rOmpA刺激下,β-rOmpA免疫组小鼠产生的IFN-γ、IL-17A水平显著高于T-rOmpA和I-rOmpA免疫组(P<0.05);用E.coli 2002-1菌株腹腔攻毒后,β-rOmpA免疫组小鼠肝、脾、肺、肾中的细菌定植量显著低于T-rOmpA免疫组和I-rOmpA免疫组(P<0.001);攻毒后第2 d PBS对照组小鼠免疫保护率为0时,β-rOmpA免疫组为60%,T-rOmpA免疫组为40%,I-rOmpA免疫组为30%。结果表明,β-环糊精复性纯化的rOmpA免疫原性最好,诱导机体产生免疫应答和免疫保护作用最强。