辣椒小G蛋白CaROP的生物信息学分析

【目的】研究辣椒内小G蛋白CaROP的生物学功能、蛋白理化性质、蛋白结构及系统发育关系。【方法】运用ProtParam、ProtScale、SignalP5.0、TMHMM、NetPhos3.1和NetCGlyc1.0等生物信息学软件分析9个CaROP蛋白的蛋白理化特性;运用SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学软件预测分析9个CaROP蛋白的结构;运用生物信息学软件MEGA11分析9个CaROP蛋白的系统发育关系。【结果】9个CaROP蛋白的亲水性总平均值均小于0,均为亲水蛋白,其中6个为稳定的亲水蛋白;9个CaROP蛋白均无信号肽,即均为非分泌性蛋白;9个CaROP蛋白无跨膜结构域,即均非膜蛋白;9个CaROP蛋白均存在磷酸化位点,均无糖基化位点。9个CaROP蛋白的主要二级结构原件为无规则卷曲和α-螺旋,其次是β-折叠,最后是β-转角。9个CaROP蛋白聚为4个分支,其中分支Ⅰ和分支Ⅲ各包括1个CaROP蛋白。分支Ⅱ包括2个CaROP蛋白,其余5个CaROP蛋白均聚于分支Ⅳ中。【结论】9个CaROP蛋白具有完整的Rho功能域,均为非分泌性亲水蛋白。9个CaROP蛋白在系统进化树中共聚为了4个分支,其三级结构建模的预测结果也均较为理想,9个CaROP蛋白结构较稳定。

弓形虫MIC1、MIC6和ROP18混合蛋白对小鼠的免疫保护作用

为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血清特异性抗体,以及免疫蛋白刺激后脾细胞培养上清中各细胞因子的水平,通过脾淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞增殖情况。最后一次免疫后,用弓形虫WH3强毒株攻击,观察并记录小鼠的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,蛋白免疫组产生高滴度的IgG和IgG亚型(IgG1和IgG2a)抗体,滴度可高达1∶128000。细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平不同程度地升高,并且重组蛋白能够诱导淋巴细胞特异性增殖。免疫组小鼠的生存时间较对照组有所延长,其中MIC6-ROP18组延长时间最长(P<0.01)。MIC1、MIC6和ROP18组成的重组疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,其中MIC6-ROP18蛋白组合的免疫保护效果更为明显,但仍需进一步改进。本研究为弓形虫疫苗的研发提供了思路。

FOPS&ROPS翻滚试验台液压控制系统性能研究

为防止车辆侧翻和高空坠物对驾驶员造成伤害,矿山工程车辆普遍配备了FOPS&ROPS安全保护系统。这类车辆体积庞大、种类繁多,在优化改进FOPS&ROPS时多采用仿真技术,对其实际性能的检测需求也在不断增加。在中国,这类车辆必须经过有资质的检测机构对FOPS&ROPS进行检验并出具报告后才能投入使用。目前,国内外正积极开发FOPS&ROPS安全保护系统的试验平台,以进一步验证车辆的FOPS&ROPS性能是否符合标准规定,特别是当驾驶室变形时,DLV区域是否遭受侵犯。值得注意的是,国内搭建的ROPS试验台通常较为复杂,有的仍采用原始的油缸手动加载方式,这种方式载荷小且适用范围有限。因此,设计了一套基于FOPS试验台的ROPS液压控制系统,通过性能分析与试验验证来实现矿山工程车辆FOPS&ROPS的能力验证。结果表明:该ROPS液压控制系统能够满足矿山工程车辆ROPS安全保护系统性能验证分析的要求。

采后玉露桃果实冷害发生与ROP基因的表达调控

以软溶质玉露桃果实为材料,于8℃、5℃、0℃和LTC(8℃锻炼3d再转到0℃贮藏)下贮藏30d后转至货架(20℃)2d,对各个处理果实的腐烂和冷害程度、果实品质变化规律以及ROP基因的表达模式进行了比较,以探讨ROP基因与低温胁迫的关系。结果表明,经5℃和0℃贮藏30d的玉露桃果实在货架期间褐变加重,经5℃处理的果实褐变最重,经0℃处理果实表现后熟障碍;经8℃贮藏30d以及后续2d货架期的果实不出现冷害症状,但果实腐烂严重;LTC处理果实经冷藏后在货架期后熟正常,且果实冷害和腐烂均被明显抑制。各处理桃果实在采后低温贮藏过程中总可溶性糖和总有机酸质量分数均趋下降,其中5℃处理果实总可溶性糖质量分数下降幅度最大。结合应用EST检索和RT-PCR克隆扩增,分离出桃ROP基因(PpROP)。实时定量PCR结果显示,PpROP在5℃下表达迅速增强,第5天达到高峰,其丰度明显高于其他处理,LTC处理使PpROP表达维持较低水平。

弓形虫ROP5基因真核表达载体的构建及其免疫保护性的研究

目的构建弓形虫pcDNA-ROP5真核表达载体,观察弓形虫ROP5基因在小鼠体内诱导的免疫反应。方法克隆弓形虫ROP5基因,将其插入真核表达载体pcDNA-3.1中构建重组质粒pcDNA-ROP5,脂质体法转染Hela细胞体外表达蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定。将45只小鼠随机均分为3组,分别为PBS组、空质粒组、pcDNA3.1-ROP5组,每2w肌注免疫(100μg/只)1次,共3次,于免疫前及每次免疫前1d和末次免疫后2w收集小鼠血清,用间接ELISA法检测血清抗弓形虫的IgG。各组小鼠腹腔注射RH株弓形虫速殖子1 000个/每鼠,观察小鼠受攻击感染后的存活时间。结果真核表达载体构建成功,Western blotting分析结果显示,重组质粒pcDNA3.1-ROP5能在Hela细胞表达,蛋白相对分子质量为61kDa。pcDNA3.1-ROP5末次免疫后血清中IgG水平显著高于其他组,pcDNA-ROP5免疫的小鼠与对照组相比,实验组小鼠产生了明显的体液免疫应答。攻击感染试验中,实验组的小鼠比对照组的存活时间有明显延长。结论构建的真核表达重组质粒pcDNA-ROP5对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。

弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察

目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

刚地弓形虫强毒株棒状蛋白ROP18的克隆、表达和免疫反应性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白TgROP18的表达情况。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blot-ting)分析该重组蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增获得TgROP18基因,长约1 665 bp,编码554个氨基酸,其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgROP18构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)为59 800的可溶性重组蛋白TgROP18。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。结论重组蛋白TgROP18具有一定的免疫反应性。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒，为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段，重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，再经含氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段，克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１；经亚克隆，筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒，亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。

工程车辆ROPS动态仿真与试验研究

提出了基于整车的ROPS动态仿真建模方法和滚翻试验方法;以轮式装载机模型在倾角为30°的硬斜坡滚翻工况为例,进行了ROPS仿真结果和试验结果对比,验证了建模方法的合理性;揭示了碰撞过程中ROPS的冲击力、变形和能量吸收规律。

弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1在大肠杆菌中表达的初步研究

目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果 获得pET2 8-SAG1/ROP1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/ROP1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论 弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。

蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因的克隆与表达分析

【目的】对蒺藜苜蓿ROP基因进行克隆与表达分析,为深入研究ROP基因在豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】依据拟南芥11个ROP保守序列特征和蒺藜苜蓿数据库信息,同源克隆蒺藜苜蓿的MtROP9基因,采用生物信息学方法对该基因序列进行分析,并采用半定量RT-PCR法,对MtROP9基因在蒺藜苜蓿不同组织及根瘤菌侵染后不同时间根系中的表达水平进行检测。【结果】从蒺藜苜蓿根系中克隆到了MtROP9基因的cDNA序列,全长为947 bp,编码209个氨基酸。序列分析表明,MtROP9具有ROP蛋白典型的结构特征,并与拟南芥AtROP9、水稻OsRac2、葡萄VvROP9、玉米ZmROP6和ZmROP7具有高度的相似性。MtROP9基因具有一定的时空表达特性,在根系和花中表达水平较高,在茎和根瘤中表达水平相对较低,在叶中几乎不表达。在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作的早期,MtROP9基因能够被根瘤菌侵染诱导表达,在根瘤菌诱导处理不同时间的根系表达水平不同。【结论】克隆了蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因。MtROP9基因可能参与了豆科植物与根瘤菌共生互作早期信号的调控。

蒺藜苜蓿小G蛋白ROP在共生过程中的作用：1．MtROP5的克隆和表达分析

【目的】对蒺藜苜蓿ROP进行克隆与表达分析,为深入研究ROP在共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】通过比较基因组学和RT-PCR方法克隆了蒺藜苜蓿的MtROP5,采用半定量RT-PCR方法检测了MtROP5在蒺藜苜蓿不同组织中的表达水平,采用荧光实时定量PCR方法检测了MtROP5在根瘤菌侵染宿主植物根系后72h内不同时间阶段的表达水平。【结果】从蒺藜苜蓿中克隆了含有MtROP5完整编码区的cDNA序列,长度826bp,编码197个氨基酸。序列分析表明,MtROP5编码的蛋白具有典型的ROP蛋白特征结构域,与其它几种植物中ROP蛋白具有高度的同源性和相似性。半定量RT-PCR分析表明,MtROP5在蒺藜苜蓿的根、茎、叶、花、根瘤中均有表达,茎和花中表达量最高,根和根瘤中次之,在叶中表达最弱。荧光实时定量PCR分析表明,与未接种根瘤菌的对照处理相比较,MtROP5在根瘤菌侵染的72h内不同时间阶段的根系中都增强表达。【结论】克隆的cDNA序列是一个蒺藜苜蓿小G蛋白ROP,推测MtROP5可能在共生互作的早期信号传导过程中行使一定的调控作用。

拟南芥不同ROP蛋白对病原细菌增殖的影响

ROP蛋白是植物特有的一类小G蛋白,在植物信号传导途径中起重要作用.拟南芥共编码11种ROP蛋白,为明确ROP蛋白在拟南芥抗病反应中的作用,将病原细菌Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000接种于各AtROP的激活和失活突变体后,观察其增殖情况.结果表明,AtROP2和AtROP11抑制病原菌的增殖,而AtROP10则促进病原菌的增殖,其他At-ROP对Pst.DC3000的增殖没有影响.

蒺藜苜蓿小G蛋白ROP在共生过程中的作用:2.MtROP5调节根毛生长发育的功能分析

【目的】对蒺藜苜蓿MtROP5的功能进行研究,为阐明植物ROP在共生互作过程中的调控机制奠定基础。【方法】采用PCR方法克隆MtROP5的启动子序列,并构建了MtROP5的相关表达载体。利用发根农杆菌介导的遗传转化方法,对MtROP5启动子的表达模式以及MtROP5的功能进行了分析。【结果】克隆了MtROP5翻译起始位点上游2.1kb左右预测的启动子序列,MtROP5启动子驱动GUS在根系的各个部位中都有表达,在维管束组织和侧根起始的分生组织中表达较强,并且其启动子转录活力在受到根瘤菌侵染后诱导增强表达;MtROP5的过量表达和组成型激活突变均能显著促进根毛的伸长,相比对照转化根系,根毛长度分别增长了74.6%和54.8%,而通过RNAi干扰降低MtROP5的转录水平后,根毛的生长发育明显受到了抑制,其转化根系的根毛缩短了47.6%,但MtROP5显著性失活突变转化根系的根毛长度与对照转化根系没有显著差异。【结论】蒺藜苜蓿MtROP5调节了根毛的生长发育,并可能参与宿主植物与根瘤菌共生互作早期的信号传导过程。

酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白

目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用,利用酵母双杂交系统从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白。结果构建了诱饵载体pGBKT7-ROP18,ROP18具有自激活功能。用ROP18^(25-25lan)为诱饵,筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白:DNA损伤特异性结合蛋白1(DDB1)、torsin A相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、整联蛋白β1(integrinβ1)、溶质运载蛋白3(SLC3A2)、酪氨酸硫化转移酶2(TPST2)、Derl样域家族成员2(DERL2)和OCIA结构域蛋白1(OCIAD1)。结论通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白。

顶复门原虫棒状体蛋白ROP18的研究进展

顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子。其中ROP18是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的ROP2家族蛋白成员之一,在刚地弓形虫入侵宿主细胞阶段发挥重要作用,是纳虫空泡(PV)形成时宿主细胞免疫的抑制因子。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。本文以目前研究最多的刚地弓形虫ROP18为主,对其发现历史、结构、分泌及定位、对宿主的毒力机制及应用现状做一综述。

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法 根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR I、Not I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株(HT株)ROP5蛋白基因。方法运用RT-PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因,将其克隆入T载体中进行测序和分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp,编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比,有12个核苷酸有差异,导致7个氨基酸发生改变,两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.9%。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白,并且能与弓形虫抗体发生血清学反应,表达量占菌体蛋白的15.6%。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

弓形虫RH株ROP1抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达ROP1抗原。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株cDNA文库中扩增得到编码ROP1的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并用SDS -PAGE和Westernblotting进行鉴定。 结果 ( 1)在我们比较的 12 4 9个碱基中 ,我们得到的ROP1基因在Ossorio报道的基因的 4 4 7位与 4 4 8位之间有一 96bp的插入片段 ,另有 14个碱基不同 ,造成 3个氨基酸的改变 ,两基因之间有 91.19%的同源性 ,( 2 )得到一分子量约为 70kDa的融合蛋白。结论 1,我们获得了一与Ossorio报道的基因有较大差异的rop1基因 (GeneBank登录号 :AF3 5 0 2 61) ( 2 ) ,ROP1基因在大肠杆菌中得到了ROP1融合蛋白的高效表达。