基于CRISPR/Cas9技术的弓形虫rop16_(I/III)缺陷虫株的构建及毒力鉴定

目的构建并鉴定弓形虫RH株rop16_(I/III)缺陷虫株。方法利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株。运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒。此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株。PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔrop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵。并比较RH株和RHΔrop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。结果经测序比对,成功构建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒。PCR鉴定结果显示,DHFR编码(编码乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶点位置,Western blotting分析结果未见RHΔrop16株有Rop16_(I/III)蛋白表达。吉姆萨染色后计数结果表明,RH株感染的细胞内每个纳虫泡内速殖子的平均数显著高于RHΔrop16虫株。毒力试验结果显示,RH株感染的小鼠在第7d即出现死亡,而rop16_(I/III)缺陷株在第9d出现死亡,但两种弓形虫株感染动物在第10d均全部死亡,两组间无统计学差异。结论利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16_(I/III)缺陷的弓形虫RH虫株,rop16_(I/III)基因敲除对弓形虫RH株毒力无明显影响。

弓形虫棒状体ROP16基因转染RAW264.7的实验研究

目的比较目前常用的5种基因导入技术将弓形虫棒状体ROP16基因导入RAW264.7,选择合适的方法提高转染效率。方法以绿色荧光蛋白p EGFP-ROP16融合表达构建质粒,采用Lipofectamine3000、Attractene、FugeneHD转染试剂以及电穿孔转染和慢病毒载体感染RAW264.7,利用荧光显微镜和流式细胞仪观察目的基因的表达、细胞生长状态并分析转染效率,从而确定最佳的基因导入途径。结果上述质粒载体对RAW264.7的转染效率依次为电转法>FugeneHD>Lipofectamine3000>Attractene。但是电转法转染后细胞死亡率较高,细胞贴壁不牢或死亡;而慢病毒感染效率可达61.2%,细胞生长状态佳,显著优于质粒载体(P<0.05)。慢病毒组显著优于4个质粒组(P<0.05)。结论慢病毒感染可将弓形虫棒状体ROP16成功转入RAW264.7,具有较高的转染效率,效果显著优于质粒载体,目的基因在细胞内获得高效表达。为弓形虫ROP16的功能研究提供了重要基础。

弓形虫RH株ROP16Ⅰ/Ⅲ基因缺陷虫株感染BALB/c鼠的致病性研究

目的旨在深入研究弓形虫棒状体效应分子ROP16与虫株毒力及致病性的关系。方法 采用弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ基因敲除RH株(RHΔROP16)攻击感染BALB/c小鼠,在感染后不同时间点与野生株感染鼠比较,动态观察感染动物发病症状、存活时间;HE染色观察脑组织、肺组织病理学差异,qRT-PCR检测脾细胞炎性及抑炎细胞因子表达水平。结果两组小鼠的发病症状无明显差异;经HE染色显微镜下观察小鼠肺部及脑部病理学改变亦未见无明显差异;qRT-PCR检测并用Graphpad分析两组虫株感染小鼠的脾细胞Arg-1、IL-10、IL-12、TNF-α及IFN-γ等细胞因子表达水平。数据表明在感染相同时间ROP16缺陷株感染小鼠Arg-1的表达量明显低于野生型虫株(P<0.05);而IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论Ⅰ型弓形虫RH株的ROP16Ⅰ/Ⅲ并非是决定急性感染期弓形虫毒力的唯一效应分子;ROP16Ⅰ/Ⅲ可诱导宿主Arg-1高表达,提示与巨噬细胞内虫体的增殖有关。