弓形虫ROP16蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的探讨弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白在人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期及凋亡方面的作用。方法以空载体(MCF-7-HBLV)和过表达ROP16蛋白的慢病毒(HBLV-RH ROP16)分别感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达ROP16的细胞株,Real time PCR、Western blot法检测MCF-7细胞中ROP16 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡。Western blot法检测细胞周期及凋亡相关蛋白表达。结果相比MCF-7-HBLV(空载体组)和MCF-7细胞组(对照组),MCF-7-RH ROP16细胞组中ROP16 mRNA和蛋白表达升高;细胞增殖率降低(P<0.01);S期细胞比例、细胞凋亡率升高(P<0.01)。促凋亡因子Bax、P53、Caspase-9、Caspase-3及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21表达增高(P<0.01);抗凋亡蛋白Bcl-2及细胞周期蛋白A1(CyclinA1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达均下降(P<0.01)。结论弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白可通过调节与凋亡、周期相关的细胞因子的表达,诱导MCF-7细胞凋亡,抑制其增殖并引起细胞周期阻滞。

Chinese1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的构建弓形虫Chinese 1基因型Tg Ct Wh3(以后均简称Wh3)株棒状体蛋白(rhoptry protein,ROPs)16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至p MD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3D结构。结果各组均PCR扩增出约2.1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以p ET-28a和p EGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。

弓形虫ROP16蛋白诱导肝癌细胞凋亡的检测

目的观察弓形虫ROP16蛋白转染肝癌细胞Hep G2后,肝癌细胞的凋亡比率的变化以及细胞凋亡蛋白的表达水平变化。方法克隆弓形虫ROP16基因,构建真核转染质粒,并用脂质体转染的方式转染Hep G2细胞,48小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡比率,用western blotting和RT-PCR的方法检测细胞凋亡相关蛋白caspase-9、Bax、Bcl-2等的表达水平。结果与未转染细胞组相比,弓形虫ROP16转染Hep G2细胞后,肝癌细胞的凋亡比率明显升高。促细胞凋亡蛋白caspase-9、Bax的蛋白表达水平和基因转录水平均升高,而抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达水平和转录水平下降。结论 ROP16蛋白可以诱导肝癌细胞Hep G2发生凋亡。

弓形虫ROP16蛋白与NKRF互作对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡和周期的影响

为探讨刚地弓形虫Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16蛋白与NKRF互作对A549细胞凋亡、周期及增殖的影响。本研究通过构建过表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白和空载体对照组的慢病毒感染A549细胞,并通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western-blot对Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16的表达进行验证。利用免疫共沉淀与液相色谱-质谱联用技术获取同ROP16可能发生互作的蛋白,并利用Venn图、Score分值、Intensity分值筛选出评分较高的互作蛋白NKRF进行验证。设计并合成NKRF-siRNA,分别转染至过表达Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16细胞,并利用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,利用RT-qPCR和Western-blot分别对凋亡相关蛋白及细胞周期相关蛋白的m RNA和蛋白表达水平进行检测。此次试验成功构建了Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16过表达A549稳转细胞株。利用IP-MS及CO-IP技术筛选并验证ROP16互作蛋白NKRF。筛选并构建NKRF沉默的过表达各型ROP16蛋白A549细胞。在过表达Ⅰ型、Ⅲ型ROP16的A549细胞中,促凋亡蛋白Bax表达水平上调,抑凋亡蛋白BCL-2、Caspase-9、p53表达水平明显下调;细胞周期抑制蛋白p21表达明显上调,而G1/S期相关蛋白CDK6和CyclinD1蛋白表达明显下调,提示Ⅰ、Ⅲ型ROP16蛋白会引起细胞凋亡和周期停滞,而在沉默NKRF组中,过表达Ⅰ型、Ⅲ型ROP16蛋白的A549细胞中Ⅰ型、Ⅲ型ROP16蛋白的促凋亡作用减弱,细胞周期无明显停滞,与Ⅱ型ROP16蛋白之间没有统计学差异。综上所述得出弓形虫Ⅰ、Ⅲ型ROP16蛋白通过与NKRF互作,诱导A549细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制A549细胞增殖。

弓形虫Ⅱ型ROP16蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞增殖凋亡迁移和侵袭的影响

为探讨弓形虫Ⅱ型(ME49)ROP16蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,利用Ⅱ型ROP16(MCF-7-ROP16Ⅱ)和空载体(MCF-7-HBLV)慢病毒载体分别感染MCF-7细胞,用实时荧光PCR、Western-blot验证ROP16蛋白在MCF-7细胞的表达,用CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡,用细胞划痕试验和Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,用Western-blot检测凋亡相关因子Bax、p53、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3的表达。结果显示:相比MCF-7-HBLV(空载体组)和MCF-7细胞组(空白组),过表达组(MCF-7-ROP16Ⅱ)中ROP16 m RNA和蛋白表达显著升高;过表达组的细胞增殖率、侵袭率和迁移率显著降低(P<0.05);而细胞凋亡率显著升高(P<0.05);促凋亡因子Bax、p53、Caspase-3、Caspase-9高表达(P<0.05),而抗凋亡因子Bcl-2低表达(P<0.05)。结果表明,弓形虫Ⅱ型ROP16蛋白抑制MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭,且诱导细胞凋亡。

刚地弓形虫ME49虫株ROP16蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学方法分析弓形虫ME49虫株ROP16蛋白(ME49-ROP16)的理化性质、结构特点等,并预测其潜在的B、T细胞抗原表位及其互作蛋白,为弓形虫疫苗的研究提供理论基础。方法登录NCBI数据库下载ME49虫株ROP16蛋白的氨基酸序列,利用在线软件ProtParam预测ROP16蛋白的理化性质;使用ProScale预测ROP16蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性及β-折叠;采用SignalP-4.1预测ROP16蛋白的信号肽;运用TMHMM-2.0预测ROP16蛋白的跨膜结构;利用SOMPA和Phyre2预测ROP16蛋白的二、三级结构;通过Netphos3.1、NetNGlyc1.0、YinOYang-1.2预测ROP16蛋白的磷酸化位点、N-糖基化位点和O-糖基化位点;运用Predicting Antigenic Peptides预测ROP16蛋白的抗原决定簇;使用IEDB预测ROP16蛋白的优势B细胞表位;运用SYFPEITHI预测ROP16蛋白的T细胞优势表位;采用STRING预测软件分析与其相互作用的蛋白。结果ME49-ROP16蛋白由707个氨基酸组成,分子式为C_(3338)H_(5350)N_(966)O_(1033)S_(21),相对分子质量76.21631×10^(3),其理论等电点是8.97,不稳定系数为59.30,为不稳定蛋白;脂溶性指数为79.25,总的平均亲水性为-0.320,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋占35.64%,延伸链占10.75%,β-转角占5.94%,无规卷曲占47.67%;该蛋白含有83个氨基酸磷酸化位点,14个N-糖基化位点,无O-糖基化位点。ME49-ROP16蛋白具有信号肽序列,无跨膜结构;其平均抗原倾向指数为1.0340,共有25个抗原决定簇区域,有7条B细胞优势表位,14条CTL细胞优势表位,14条Th细胞优势表位,与ACC1、ACC2、PKG、ROP18为互作蛋白。结论生物信息学分析ME49-ROP16蛋白为不稳定亲水性蛋白,含有多个B、T细胞优势表位,并与ACC1、ACC2、PKG、ROP18为互作蛋白,为以该蛋白为靶点的弓形虫疫苗研制奠定了基础。

弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

棒状体蛋白16(ROP16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,其蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中的重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6,干扰宿主细胞信号通路传导,在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。本文对弓形虫ROP16的发现、功能、免疫保护性等方面进行综述。

弓形虫VEG株ROP16蛋白对THP-1细胞免疫调节及机制研究

为了探究弓形虫VEG株ROP16蛋白在THP-1细胞中的表达及对其免疫反应的影响和相关机制,本研究利用慢病毒构建过表达ROP16(overEep-ROP16)载体,空载体(overEep-NC)为对照,通过转染THP-1细胞构建稳转细胞株,对其荧光蛋白表达情况、ROP16在THP-1细胞中的表达及定位进行检测;通过RT-PCR检测炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-10、IL-12 mRNA相对表达水平;Western-blot方法检测炎性小体NLRP3、Caspase-1蛋白与信号通路蛋白STAT3、pTyr705-STAT3的表达水平。结果显示,构建的过表达ROP16重组慢病毒转染THP-1细胞后可观察到强绿色荧光,在THP-1细胞中rop16基因在mRNA与蛋白水平均成功表达且该蛋白定位于THP-1细胞核;与对照组相比,过表达组促炎细胞因子IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表达水平上调(P<0.01),而IL-12 mRNA下调(P<0.01),抗炎细胞因子IL-10 mRNA上调(P<0.01),炎性小体NLRP3、Caspase-1蛋白与信号通路蛋白pTyr705-STAT3相对表达量上调(P<0.01),STAT3无显著变化(P>0.05)。上述结果表明,构建的过表达ROP16重组慢病毒稳转染至THP-1细胞内并表达蛋白,表达的蛋白定位于THP-1细胞核内,该蛋白能激活NLRP3炎性小体促发炎症的发生并通过磷酸化STAT3 Tyr705调控抗炎作用。

弓形虫Ⅰ/Ⅱ型ROP16蛋白对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡和周期及增殖的影响

为了探讨刚地弓形虫Ⅰ(RH)、Ⅱ(Me49)型ROP16蛋白对SH-SY5Y细胞凋亡、周期及增殖的影响,本研究通过表达Ⅰ、Ⅱ型ROP16蛋白(HBLV-ROP16Ⅰ、HBLV-ROP16Ⅱ)和空载(HBLV-NC)的慢病毒感染SH-SY5Y细胞以获得稳转株,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western-blot验证SH-SY5Y细胞内ROP16过表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,CCK-8法检测细胞增殖情况,RT-PCR和Western-blot分别对凋亡相关因子(Bax、p53、Bcl-2、Caspase-9)及细胞周期相关因子(p21、CDK6)的mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果显示,相比于空白组(Control)和空载体组(HBLV-NC),过表达组(HBLV-ROP16Ⅰ、HBLV-ROP16Ⅱ)细胞的ROP的16 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),说明稳转株构建成功;过表达组细胞的凋亡比率、G1期细胞比率均显著升高(P<0.05),而细胞增殖率显著降低(P<0.05),凋亡相关因子(Bax、p53、Caspase-9)及p21的mRNA及蛋白均高表达(P<0.05),而抗凋亡因子Bcl-2和促细胞周期G1/S转化因子CDK6的mRNA及蛋白均低表达(P<0.05)。相比于空白组,空载体组均无明显变化(P>0.05)。上述结果表明弓形虫Ⅰ、Ⅱ型ROP16蛋白可诱导SH-SY5Y细胞凋亡、细胞周期阻滞在G1期及抑制SH-SY5Y细胞增殖。