弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察

目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制

目的研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗。应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒。测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义(P<0.001);实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应。结论该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2(rhpotry protein 2)的部分基因,构建pGEX-KG-ROP2重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转入E.coli BL21CodonPlus中,在IPTG诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果表明,扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9%,该基因可以在大肠杆菌中高效表达,表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000,可被兔抗弓形虫免疫血清识别。

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法 根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR I、Not I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。

抗弓形虫感染ROP2核酸疫苗的研究

目的研究弓形虫核酸疫苗,以用于弓形虫病的防治。方法根据ROP2基因序列,设计合成能表达ROP2完整蛋白基因的扩增引物,扩增ROP2靶基因并克隆于PUCm-T载体,然后再亚克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗;应用裸pc-DNA3-ROP2免疫小鼠,通过免疫学指标的检测,评价小鼠的免疫应答反应,最后应用弓形虫RH株攻击实验,评价出该疫苗的有效保护率、安全性和在人类及畜类的应用价值。结果以ROP2基因为模板,PCR扩增出1.7kbDNA条带,与预想结果一致;将扩增DNA回收并成功的克隆了ROP2(PUCm-T-ROP2),然后亚克隆并构建了pc-DNA-ROP2重组体,通过酶切、PCR扩增和基因测序证明亚克隆的重组子正确,ROP2扩增基因包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列;在应用疫苗免疫接种小鼠结果显示,疫苗接种能使小鼠产生强烈的细胞、体液免疫反应;攻击实验结果显示,实验组小鼠的存活时间明显延长,并且开始死亡时间明显延迟(P<0.001),实验组9只小鼠中有1只长期存活;在实验的整个过程中,没有发现小鼠对免疫接种的毒性和异常反应。结论该疫苗免疫原作用强,具有很好的开发应用价值,目前可在动物群体中试验应用。

三种免疫调节剂增强弓形虫重组ROP2疫苗保护效应的研究

目的观察弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant,FA)、匹多莫德(Pidotimod,PT)和西咪替丁(Cimetidine,CIM)等3种免疫调节剂增强重组弓形虫棒状体蛋白2(rROP2)疫苗的免疫保护效应。方法将100只BALB/c小鼠随机分为PBS对照组、重组rROP2疫苗组、FA-rROP2疫苗组、PT-rROP2疫苗组和CIM-rROP2疫苗组等5组;FA、PT和CIM分别与rROP2抗原混合皮下注射免疫,检测小鼠细胞免疫和体液免疫指标,并观察弓形虫RH株攻击感染后的生存时间。结果 FA-rROP2组、CIM-rROP2组小鼠血清IFN-γ、特异性IgG、脾细胞增殖活性及外周血CD4+/CD8+比值均显著高于rROP2蛋白组(P<0.05);PT对外周血CD4+/CD8+比值无明显影响,但显著增加了IFN-γ的水平及脾细胞增殖活性。小鼠攻击试验表明,FA-rROP2组、PT-rROP2组以及CIM-rROP2组小鼠存活时间显著长于rROP2组和PBS对照组组;rROP2蛋白组各项指标均显著高于PBS组(P<0.05)。结论 FA、PT和CIM可增强rROP2蛋白抗原诱导的细胞免疫和体液免疫反应,都能延长攻击感染小鼠的生存时间,具有增强rROP2蛋白疫苗保护效应的功能。其中CIM的佐剂样免疫促进作用接近于FA,但副作用显著低于后者,具有临床实用的潜在价值。

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段,克隆至表达载体pET22b中,导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段,克隆至质粒pUC119中,经PCR和酶切鉴定后,进行DNA序列测定,并以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上,重组质粒pET22b-ROP2转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株中,经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1.0kb的ROP2基因片段,构建成功重组质粒pUC119-ROP2,经DNA序列分析与已报道序列基本一致,重组质粒pET22b-ROP2在大肠杆菌中表达,产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达,构建成功的重组质粒pUC119-ROP2可用于下一步多基因融合的克隆操作。

刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB/c小鼠免疫保护性的研究(英文)

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫P30-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M.S载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3,构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2,电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中,潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子,温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体,SDS-PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗,为弓形虫病的防治提供了一种新方法。

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 。

弓形虫上海株的棒状体蛋白ROP2的克隆表达及纯化

根据已发表基因序列(GenBank登录号为Z36906)设计引物,以弓形虫(Toxoplasma gondii)上海本地株的基因组DNA为模板,扩增编码ROP2(rhpotry protein2)蛋白的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+),重组质粒经限制性酶切鉴定后测序,结果表明插入片段长度为1044bp,与GenBank上登录的序列相比,同源性为96%-100%,其中与弓形虫RH株的rop2基因同源性为100%。重组原核表达质粒pET32a-rop2转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约60.9kD的融合蛋白,能被感染弓形虫RH株的绵羊阳性血清识别。

弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2），并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子，提取总RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增ROP2基因全长，与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接，在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2，最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白，初步证明其良好的免疫反应性，为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法，研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

弓形虫ROP2基因在大肠杆菌内高效表达条件的优化

采用SDS-PAGE方法检测弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白(Rhoptry protein)ROP2基因原核表达质粒在大肠杆菌BL21Codon Plus中的表达量。通过改变菌体密度、诱导剂浓度和诱导时间进行高效表达条件的优化。结果显示,在菌体密度D600nm为0·6、IPTG浓度为0·4mmol·L-1和诱导表达3.5h时,融合蛋白的表达量最大,达到159mg·L-1培养液。这为利用重组ROP2研究和制备弓形虫病的诊断抗原奠定基础。

弓形虫p30-Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒的构建

目的：构建弓形虫p30—Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用PCR技术从已构建的pET30-p30-Rop2质粒扩增p30-Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-p30-Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析。结果：成功构建pSTM3-p30-Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框。结论：pSTM3-p30—Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法42只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、空质粒组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50μg、pc-DNA3空质粒50μg和PBS50μl,共免疫3次,每次间隔3周,末次接种量均加倍。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个,观察其存活时间等。结果ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠的CD4+T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+比值显著升高(4.69±1.32)%(P<0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,实验组小鼠免疫保护率为88.9%,与对照组相比,小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟(P<0.01)。结论ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用。

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2(ROP2)靶基因,构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物,应用PCR扩增ROP2基因片段,回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T;用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子,将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3,并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7kbROP2基因片段,克隆于pUCm-T载体中,再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3,经筛选鉴定,构建pc-DNA3-ROP2重组质粒;测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。结论弓形虫ROP2基因片段,经TA克隆及亚克隆,构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。

可溶性弓形虫棒状体分泌蛋白2(ROP2)的免疫原性和抗弓形虫感染核酸疫苗的研究

本研究方法是根据ROP2基因序列,设计合成能表达ROP2完整蛋白基因的扩增引物,扩增ROP2靶基因并克隆于PUCm-T载体,鉴定正确后,再将重组子亚克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,并进一步应用PCR、双酶切、测序等鉴定其重组子的正确性。