弓形虫鸡尾酒DNA疫苗的免疫保护作用研究

研究旨在构建弓形虫鸡尾酒DNA疫苗并评价其对小鼠的免疫保护效果。研究将编码弓形虫棒状体蛋白ROP5、ROP9和ROP17的基因分别构建至真核表达载体pVAX1上,获得重组真核表达质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9和pVAX1-ROP17,将上述质粒进行PCR和双酶切验证,并通过Western blot检测重组质粒在真核细胞中表达。将三种重组质粒按1∶1∶1的比例混合后,取100μg通过腿部肌肉注射免疫小鼠,加强免疫后,检测小鼠血清抗体、脾淋巴细胞增殖及细胞因子水平,并接种弓形虫RH强毒株进行攻毒,评价免疫后小鼠的保护效果。真核表达质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9和pVAX1-ROP17经PCR和双酶切验证的结果显示:分别在1686bp、1128bp和1836 bp处出现特异性目的条带;Westernblot检测结果发现,在约为62、41和68kDa处出现目的条带,分别与预期目的蛋白ROP5、ROP9和ROP17的分子量大小相符。与空载体组和生理盐水组小鼠相比,疫苗免疫组小鼠产生的血清中抗体IgG和淋巴细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-6水平、脾脏淋巴细胞增殖的刺激指数(SI)均极显著升高(P<0.01),且接种弓形虫RH强毒株后,免疫组小鼠的存活时间(16.1±2.07)比对照组小鼠存活时间(9.2±0.74或9.0±0.77)极显著延长(P<0.01)。研究结果表明,成功构建的弓形虫鸡尾酒DNA疫苗pAX1-ROP5/ROP9/ROP17能激发小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应,并增强小鼠对弓形虫感染的抵抗能力。研究结果为弓形虫新型疫苗研制提供借鉴和参考。

利用酵母双杂交筛选与弓形虫棒状体蛋白9相互作用的宿主蛋白

【目的】扩增弓形虫(Toxoplasma gondii)RH虫株速殖子的棒状体蛋白9(ROP9)基因,构建诱饵载体,转化Y2H Gold酵母感受态细胞,进行自激活活性检测,运用酵母双杂交系统筛选与ROP9存在相互作用的人脑组织蛋白质。【方法】运用RT-PCR扩增弓形虫RH虫株速殖子ROP9基因,构建诱饵载体pGBKT7-ROP9,转化Y2H Gold酵母感受态细胞,进行自激活活性检测,以转化诱饵载体pGBKT7-ROP9的Y2H Gold酵母菌株与人脑cDNA文库转化的Y187菌株双杂交筛选与ROP9相互作用的宿主蛋白,对阳性克隆进行测序,并用BLAST分析,筛选出与ROP9存在相互作用的人脑组织蛋白质。【结果】运用酵母双杂交系统,筛选出5个与ROP9相互作用的捕获蛋白质:内质网凝集素蛋白1(ERLEC1)、细胞色素c氧化酶铜分子伴侣(COX11)、驱动蛋白结合蛋白(KIAA1279)、GRCh38、膜联蛋白A11(ANXA11)。【结论】首次运用酵母双杂交技术筛选出与弓形虫ROP9相互作用的宿主蛋白质,为进一步研究ROP9与宿主细胞相互作用和机理奠定基础。