Vav^(Cre)介导的荧光报告系统对小鼠小胶质细胞的标记效率

目的:探讨Vav^(Cre)介导的荧光报告系统对小胶质细胞的标记效率。方法:将Vav^(Cre)/Rosa26REYFP fl/fl雄鼠与C57BL/6雌鼠杂交获得Vav^(Cre)/Rosa26REYFP^(fl/-)和Rosa26REYFP^(fl/-)子代。以发现雌鼠阴道栓的时间标记为E0.5,流式细胞术检测EYFP在E7.5~E8.25、E10~E10.5、E12~E12.5、E14~E14.5小鼠胚胎和新生小鼠小胶质细胞中的表达。结果:Vav^(Cre)/Rosa26REYFP^(fl/-)组E10~E10.5、E12~E12.5、E14~E14.5胚胎和新生小鼠小胶质细胞中EYFP阳性率高于Rosa26REYFP^(fl/-)组(P<0.001),且均>95.000%。Vav^(Cre)/Rosa26REYFP^(fl/-)E7.5~E8.25小鼠胚胎中EYFP阳性率为(0.059±0.009)%。结论:以Vav^(Cre)介导的荧光报告系统可以稳定、高效地标记小鼠小胶质细胞,可以用于动态监测小胶质细胞的发育。

增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定

目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具。方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定。结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色)。这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达。结论:构建了UH增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础。

ERT2-Cre诱导的Rosa26R-YFP报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率检测

目的 探索ERT2-Cre诱导的黄色荧光蛋白（YFP）报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率.方法 通过基因型分型的方法,从Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠杂交得到的后代中,筛选出YFP及ERT2-Cre双阳性转基因杂交小鼠;采用免疫磁珠法从双阳性转基因小鼠骨髓细胞中富集c-kit＋造血干祖细胞群进行体外培养,并用不同浓度4-羟基它莫西芬（OHT）作用不同时间以诱导YFP表达;流式细胞术检测c-kit＋造血干祖细胞中YFP的表达量.结果 Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠的杂交后代共9只,采用基因型分型方法筛选出双阳性转基因小鼠5只;体外培养的c-kit＋细胞部分形态发生变化,提示存在细胞分化;流式细胞术检测到c-kit＋细胞中YFP表达量可达13.7％.结论 YFP报告基因系统在OHT诱导的ERT2-Cre作用下,能有效标记小鼠造血干祖细胞.

Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白有效标记脑小胶质细胞

目的构建Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)报告基因小鼠,检测Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞的效率。方法将Tnfrsf11a^(Cre)小鼠与Rosa26^(yfp)小鼠交配,通过PCR筛选出Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)报告基因小鼠。分离成年Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)小鼠脑小胶质细胞、肝脏巨噬细胞、肾脏巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、脾脏巨噬细胞,标记流式抗体,通过流式细胞术分析Tnfrsf11a^(Cre)介导荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞的效率。结果Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白YFP对脑小胶质细胞具有约91.27%的标记效率,但对肝脏、脾脏、肺泡巨噬细胞细胞的标记效率分别只有约63.60%、69.66%、32.76%。结论Tnfrsf11a^(Cre)可以介导YFP对脑小胶质细胞进行示踪。同时,Tnfrsf11a^(Cre)可用做脑小胶质细胞基因条件性敲除的工具鼠。