高效液相色谱法测定β-内酰胺抗生素中残留乙酸的含量

目的建立测定β-内酰胺类抗生素原料中乙酸残留量的HPLC方法。方法采用多因素组内设计方法,确定色谱流动相的组成、比例和pH值。参考ICH Q2,从专属性、检出限和定量限、线性、准确度、精密度和耐用性等6个方面对方法进行验证。用所建立的方法对19种β-内酰胺类抗生素原料进行了测定。结果采用C_(18)色谱柱,流动相:甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾,梯度洗脱;柱温25℃;检测波长220 nm。供试品、溶剂和流动相对乙酸测定没有明显干扰;乙酸的最低检出限约为0.029μg,最低定量限约0.12μg;从定量限到限度2倍浓度范围内,方法的线性关系良好,拟合直线方程为y=388866.7186x-177.5720,r2=0.9999;低中高浓度加样回收率平均分别为93%,96%和99%;方法的重复性和中间精密度分别为2.37%和2.11%;在3根不同C_(18)色谱柱上的耐用性良好。19种β-内酰胺抗生素原料中有3种筛查出残留乙酸。结论所建方法可以实现对β-内酰胺类抗生素原料中残留乙酸的准确定量,为该类原料的生产过程控制和标准物质研制提供了依据。

基于反相高效液相色谱法的面团黏性与小麦醇溶蛋白组成关系研究

以74份不同黏性等级的小麦品种(系)为研究材料,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法分离不同黏性小麦品种的醇溶蛋白特征图谱,并进行面团黏性、醇溶蛋白组分含量与小麦面粉品质性状的相关性分析,以期建立采用少样本量快速准确识别面团黏性的方法。结果表明,经RP-HPLC分离后,ω-、α/β-和γ-醇溶蛋白3个组分在图谱上清晰可见;不同黏性等级小麦材料的醇溶蛋白得到了不同的特征图谱,黏性较大的小麦ω-醇溶蛋白的组分峰数较多,总峰面积较大;ω-醇溶蛋白在不同黏性等级小麦材料间存在显著差异。相关性分析结果表明,面团黏性与ω-醇溶蛋白相对含量呈极显著正相关,与α/β-和γ-醇溶蛋白相对含量相关性不显著;ω-醇溶蛋白相对含量与沉淀值、形成时间、稳定时间、能量、拉伸阻力和最大拉伸阻力均呈极显著负相关,与蛋白质、湿面筋含量均呈显著正相关,与弱化度呈极显著正相关;ɑ/β-醇溶蛋白相对含量与蛋白质、湿面筋含量均呈极显著正相关;γ-醇溶蛋白相对含量与小麦各品质性状均无显著相关性。可见,面团黏性主要与ω-醇溶蛋白相对含量有关,ω-醇溶蛋白对面团质量有弱化作用。

对甘精胰岛素有关物质分析用系统适用性试验的研究

目的:对不同企业甘精胰岛素有关物质分析用系统适用性试验进行研究,发现存在的问题,提示企业完善质量标准,更科学有效地控制产品质量。方法:采用高效液相色谱法及液质联用方法对不同企业有关物质分析用系统适用性试验进行研究评价,发现存在多种问题。结果:部分企业系统适用性溶液中所用的“0A-甘精胰岛素”的结构经LC-MS/MS确认后,发现与理论序列不同,部分企业采用酶切方法制备系统适用性溶液,存在杂质较多、操作步骤复杂、溶液易浑浊等问题。结论:建议企业提高对系统适用性试验的重视程度,加强研究,完善质量标准,科学有效地进行药品质量控制。

反相高效液相色谱测定氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗的研究

建立氨溴特罗口服溶液中盐酸克仑特罗成分含量测定的方法并开展方法学验证。采用ZORBAX SB-C18色谱柱,流动相为磷酸二氢钾溶液-甲醇,检测波长244 nm,柱温40℃,流速1.0 mL·min^(-1),进样量10μL。结果显示,盐酸克仑特罗在0.0511~0.4099μg·mL^(-1)范围内线性关系良好;平均回收率(n=9)为100.0079%,RSD为1.57%。测得盐酸克仑特罗含量为标示量的98.96%,符合药典标准。

浅析反相高效液相色谱中样品溶剂对中药成分色谱保留行为的影响

目的探究反相高效液相色谱(RP-HPLC)中样品溶剂对中药成分色谱保留行为的影响。方法选取2020版《中国药典》一部收载的5种中药,参照各药材含量测定项下要求进行HPLC法测定,初步研究龙胆苦苷-龙胆、紫丁香苷-刺五加、松脂醇二葡萄糖苷-杜仲、秦皮甲素-秦皮、腺苷-冬虫夏草受样品溶剂影响产生的色谱峰异常行为,深入探讨溶剂效应的机理,并提出解决方案。结果5种中药化学成分的色谱异常行为表现为保留时间漂移、色谱峰展宽、前延及裂分,产生上述异常现象的根本原因是溶解样品的溶剂和流动相存在某种不匹配,导致样品在溶剂与流动相中所处状态出现差异(溶剂效应)。消除溶剂效应的首选方法是用流动相或相近的溶剂溶解样品,此外,减小进样量和使用溶剂效应消除器可作为辅助手段。结论溶剂效应容易引起色谱峰异常,影响对化学成分定性和定量的准确性,应该在日常中药分析工作中予以重视。

HPLC-DAD双波长法同时测定鼠尾草中3个酚酸类成分的含量

建立鼠尾草中咖啡酸、原儿茶酸和迷迭香酸3个酚酸类成分含量测定的方法。采用SHIMADZU VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水(梯度洗脱),检测波长为260 nm和327 nm,柱温为30℃。结果表明咖啡酸、原儿茶酸、迷迭香酸的线性范围分别是0.45~22.53μg/mL(r=0.9999)、0.21~10.34μg/mL(r=0.9999)、0.53~21.19μg/mL(r=0.9999),平均加样回收率分别为98.60%、100.32%、99.28%,RSD分别为1.43%、1.90%、0.91%。本方法简单快速,重复性好,可用于鼠尾草中上述3种酚酸类成分的含量测定。

反相高效液相色谱法同时测定五味香连丸中10种成分含量

目的建立同时测定五味香连丸中盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、芍药苷10种成分含量的反相高效液相色谱法。方法色谱柱为Waters SunFire C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5µm),流动相为含0.02%三乙胺的0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.5)-乙腈(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,柱温为35℃,检测波长为225 nm,进样量为10µL。结果盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、芍药苷的质量浓度分别在6.852~51.39µg/mL、2.956~22.17µg/mL、2.918~21.88µg/mL、4.643~34.82µg/mL、4.871~36.53µg/mL、4.007~30.05µg/mL、4.519~33.89µg/mL、4.482~33.62µg/mL、2.724~20.43µg/mL、2.809~21.07µg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r≥0.9992,n=6);定量限分别为0.66,0.31,0.29,0.45,0.48,0.41,0.42,0.46,0.27,0.28µg/mL;精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2.0%(n=6);回收率分别为100.36%,98.74%,98.71%,99.67%,99.86%,99.59%,98.70%,98.38%,98.25%,98.72%,RSD分别为0.89%,1.02%,1.04%,1.17%,0.84%,1.15%,1.33%,1.20%,1.07%,1.23%(n=6)。3批样品中上述成分的平均含量分别为1.165~1.192 mg/g、0.5231~0.5276 mg/g、0.4997~0.5011 mg/g、0.6814~0.6889 mg/g、0.6977~0.7002 mg/g、0.6068~0.6134 mg/g、0.5801~0.5837 mg/g、0.4277~0.4422 mg/g、0.4101~0.4165 mg/g、0.4002~0.4013 mg/g(n=2)。结论所建立的方法简便可行、结果准确可靠、稳定性好,可用于同时测定五味香连丸中10种成分的含量。

RP-HPLC法同时测定茵栀解毒颗粒中绿原酸和栀子苷的含量

建立RP-HPLC法同时测定茵栀解毒颗粒中绿原酸和栀子苷的含量。采用反相高效液相色谱法,色谱柱为C_(18)柱(250.0 mm×4.6 mm,5μm),柱温30℃,流动相为乙腈‒甲醇‒0.1%磷酸(11∶8∶81),等度洗脱,检测波长为(235±1)nm,流速为1 mL/min。结果显示,绿原酸的线性范围为0.0943~0.7544μg,r=0.999999(n=5),平均回收率为99.25%(n=6);栀子苷线性范围为0.1971~1.5766μg,r=0.999999(n=5),平均回收率为99.56%(n=6)。该方法检测效率高、专属性强、重复性好,为茵栀解毒颗粒的质量评价提供了简便、准确、可靠的定量方法。

去氢孕酮有关物质的合成、确证和检测

目的:依据去氢孕酮的合成路线,合成去氢孕酮3个有关物质并进行来源分析,建立其有关物质的定量测定方法。方法:以9β,10α-孕甾-4,7二烯-3,20-二酮为起始原料,经四氯苯醌氧化得有关物质A,在无水乙醇/氯化氢溶液作用下发生双键重排得有关物质C,以9α,10β-孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮为起始原料,经对甲苯磺酸水解重排得有关物质B,有关物质测定采用RP-HPLC法,Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm,3μm)色谱柱,以乙醇-乙腈-水(V_(乙醇)∶V_(乙腈)∶V_(水)=10∶30∶60)为流动相,等度洗脱,检测波长为290 nm。结果与结论:通过化学合成得到了3个有关物质,其结构经MS、^(1)H NMR和^(13)C NMR确证;有关物质测定方法灵敏度高、专属性强,可用于去氢孕酮有关物质的测定。

红花药材RP-HPLC指纹图谱的建立及其质量评价研究

本文收集了市面上常见的红花药材,对红花的前处理方法进行优化,使用乙酸乙酯萃取等对红花进行初步提取。建立了红花药材的指纹图谱,对其中主要峰进行了化学指认,通过使用“相似度评价软件”进行数据处理,对红花药材指纹图谱的相似度进行比较分析,以研究不同产地红花药材的质量。

反相高效液相色谱法测定抗体药物中组氨酸的含量

目的建立并验证用于抗体药物中组氨酸含量测定的反相高效液相色谱法(reverse-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)。方法利用柱前衍生法建立组氨酸含量检测方法,并对该方法的专属性、准确度、重复性、中间精密度、线性、工作范围和耐用性进行验证。结果该方法专属性良好,在组氨酸的保留时间范围内,无基质缓冲液组分和分析溶剂的干扰,且供试品和对照品的组氨酸保留时间偏差为0.45%,符合可接受标准(≤5%)。5个水平的加标溶液(70%,85%,100%,115%和130%)的回收率在93.0%~102.4%之间,且3次独立测定各水平浓度的变异系数均小于5%,符合准确度、线性和检测范围的验证要求(回收率在95%~105%之间,变异系数≤5%)。组氨酸浓度在2.170~4.033 mg/ml(相当于每次进样10.85~20.15μg)范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系(R 2=0.995),且y轴截距的95%置信区间包含原点。同一份供试品溶液的6次独立测定浓度的变异系数为1.2%,符合重复性的可接受标准(≤5%);两名实验人员分别在3个工作日对同一份供试品溶液的18次独立测定的浓度的变异系数为3.1%,符合中间精密度的可接受标准(≤10%)。衍生后的待测品和对照品溶液分别在(5±3)℃密封瓶条件下在自动进样器中暂存24 h和26 h后的回收率分别为100.3%和100.2%,符合耐用性的可接受标准(95%~105%)。结论建立了柱前衍生RP-HPLC检测抗体药物中组氨酸含量的方法,该方法重现性好、专属性强、精密度及准确度高,可对其组氨酸进行质量控制。

高效液相色谱–电感耦合等离子体质谱联用测定稻米中5种硒形态

利用高效液相色谱–电感耦合等离子体质谱联用技术建立了富硒大米中5种硒形态的检测方法。采用反向C18色谱柱,对流动相离子对浓度、洗脱盐浓度、pH值进行了优化,最终确定流动相组成为15 mmol/L乙酸铵溶液,pH5.5和0.2 mmol/L四丁基氢氧化铵(TBAH),硒–甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、四价硒Se(Ⅵ)和六价硒Se(Ⅳ)5种硒形态获得基线分离。大米样品用酶提法提取,通过对酶的种类、酶的用量及酶解时间等对提取效率的研究,确定样品与蛋白酶(protease)XIV酶量比为20∶1为最佳,且最佳酶解时间为20 h。结果表明本方法分离效率高,方法线性良好,灵敏度高,回收率为77.1%~107.3%,硒–甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)的检出限和定量限分别为0.0015mg/kg和0.005 mg/kg,四价硒Se(Ⅵ)和六价硒Se(Ⅳ)检出限和定量限分别为0.0025 mg/kg和0.009 mg/kg。为全面评价富硒大米质量和后续开展富硒大米膳食暴露评估提供技术支撑。

RP-HPLC法测定安石榴苷在大鼠血浆中的浓度及其药动学研究

建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定安石榴苷的血药物浓度,并用于大鼠灌胃后的药动学研究。采用COSMOSIL-Chol-ester C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱,检测波长370 nm,柱温40℃,流速1.0 mL/min。SD大鼠单次口服安石榴苷(300 mg/kg)后,眼眶静脉丛采血,检测24h内11个时间点血浆中的药物浓度。安石榴苷在2.18~58.00μg/mL范围线性关系良好,定量下限(LLOQ)2.18μg/mL,日内、日间精密度RSD<15%,提取回收率为89.67%~115.56%。PK Slutions 2.0^(TM)药动学软件拟合主要药动学参数C_(max)、T_(max)、AUC_((0-t))分别为(26.33±5.65)μg/mL、(1.67±0.52)h和(243.40±111.62)(μg·h)/mL。所建立RP-HPLC法测定安石榴苷的血药浓度简便、准确、专属性强,给大鼠灌服安石榴苷后,其吸收、分布迅速,体内药动学呈开放的二室模型。

RP-HPLC法检测甜梦口服液(甜梦合剂)中淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰泽泻醇B的含量

目的建立同时检测甜梦口服液(甜梦合剂)中的淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰泽泻醇B含量的RP-HPLC法。方法利用Shimadzu CLC ODS C 18(4.6 mm×250 mm,5μm)分离甜梦口服液中3种成分(淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰泽泻醇B)。测定波长:淫羊藿苷为271 nm、紫丁香苷为265 nm和23-乙酰泽泻醇B为207 nm;柱温30℃,进样体积10μl。流动相:0.3%磷酸溶液(流动相A)-乙腈(流动相B),洗脱程序:0~4 min(95%A)、4~7 min(95%~78%A)、7~10 min(78%~38%A)、10~16 min(38%~26%A)、16~23 min(26%~19%A)、23~28 min(19%A)、28~28.5 min(19%~95%A)。外标法检测3种成分的含量。结果紫丁香苷、23-乙酰泽泻醇B和淫羊藿苷分别在0.1962~19.62μg/ml,0.7544~75.44μg/ml和0.1966~19.66μg/ml质量浓度范围内存在良好的线性关系,线性系数R 2均大于0.995;平均加标回收率分别为99.47%,98.68%和100.26%;仪器精密度和方法重复性RSD(n=6)均在5.0%以内。结论建立的RP-HPLC法具有线性范围广、检测结果准确等优点,可以用于甜梦口服液(甜梦合剂)供试品的质量控制。

反相高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中的聚合物类杂质

目的建立反相高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中的聚合物杂质。方法以CAPCELL PAK C_(18)MGⅡ为色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),0.25%四甲基氢氧化铵溶液(p H 5.5)[每1000mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液0.4 mL]-甲醇-乙腈为流动相系统,梯度洗脱,建立了头孢地尼聚合物类杂质的分析方法并进行了方法学验证。采用二维液质联用法对检出的聚合物类杂质进行定性分析。结果在该色谱条件下头孢地尼及已知杂质均与头孢地尼聚合物间分离良好,头孢地尼检测浓度的线性范围为0.30~30.1μg/mL(r=1.0000),方法的检测限与定量限分别为1.5 ng和4.5 ng。所建立的方法能够检出头孢地尼二聚体,头孢地尼二聚体的多个同分异构体及头孢地尼三聚体。结论本方法专属性好,灵敏度高,耐用性好,可用于头孢地尼及其制剂中聚合物杂质的控制。

畲药小香勾香豆素类成分RP-HPLC含量测定及抗炎靶点预测

[目的]以反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)法测定畲药小香勾香豆素类成分补骨脂素和佛手柑内酯的含量,并结合网络药理学和动物实验验证小香勾的抗炎作用。[方法]色谱柱为Waters C18柱(4.6 mm×250 mm,5.0μm),流动相A为乙腈,流动相B为0.1%甲酸溶液(体积比),梯度洗脱,流速为0.8 mL·min^(-1),补骨脂素检测波长245 nm,佛手柑内酯320 nm,柱温25℃。利用网络药理学平台收集小香勾香豆素类成分及抗炎相关靶点,利用Cytoscape 3.8.2软件建立成分-靶点网络,借助网络拓扑分析插件(Cytoscape network centrality analysis,CytoNCA)筛选抗炎核心靶点,进一步采用Metascape软件进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG)通路富集分析。通过二甲苯致小鼠耳肿胀法进一步验证小香勾的抗炎作用。[结果]补骨脂素和佛手柑内酯的质量浓度分别在0.51~102.00μg·mL^(-1)(r=0.9996)和0.24~48.00μg·mL^(-1)(r=0.9998)时与峰面积呈良好的线性关系。通过筛选获得小香勾补骨脂素和佛手柑内酯的相关基因57个,抗炎靶点2148个,交集靶点31个。KEGG通路富集分析发现,这些靶点主要涉及化学致癌作用-活性氧、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、癌症途径、催乳素信号通路和叶酸生物合成等信号通路。与模型对照组比较,小香勾高剂量组(400 mg·kg^(-1))能显著抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀(P<0.01),显示小香勾具有良好的抗炎作用。[结论]建立的RPHPLC法操作简单,灵敏度高,可用于小香勾质量控制。小香勾香豆素类成分通过多靶点多通路表现出良好的抗炎作用,为后续深入探讨小香勾抗炎机制提供了有利的科学依据。

同时测定大鼠体内甘草次酸和丹参酮分析方法的构建

目的:建立同时测定大鼠体内的甘草次酸和丹参酮含量的RP-HPLC方法,为甘草次酸和丹参酮复方制剂的体内药动学研究提供方法学基础。方法:采用Waters Symmetry C_(18)(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以甲醇-磷酸缓冲液(pH=3)(85∶15)为流动相进行等度洗脱;体积流速:1.0mL/min;进样量:10μL;柱温:30℃;检测波长:250nm(甘草次酸)、270nm(丹参酮)。结果:甘草次酸和丹参酮的线性范围分别为0.3125μg/mL~20μg/mL(线性回归方程为Y=0.4307X-0.0026,r2=0.9998);0.078125μg/mL~5μg/mL(线性回归方程为Y=2.2377X-0.0222,r^(2)=0.9996);甘草次酸和丹参酮在线性范围内线性良好。低、中、高三种浓度的提取回收率在95.20-103.43%之间,RSD值均小于4.93%,提取回收率良好。该方法在保留时间内未见其他干扰峰,其专属性及精密度均良好。结论:该方法可用于同时测定体内甘草次酸和丹参酮的含量。

碱性药物反相高效液相色谱分析的挑战以及改进方法

反相高效液相色谱(RP-HPLC)是广泛应用于小分子药物分析的一种有效方法。然而占药物类型多数的碱性化合物药物在反相色谱分析中经常会出现色谱峰形差、拖尾严重、载样量低现象,而且碱性越强,拖尾发生频率越大,这为碱性化合物的检测带来了难度。结合分析实验和相关文献,从高效液相色谱分析的两个关键因素(固定相、流动相)入手,总结碱性化合物在RP-HPLC分析中出现这些问题的原因和解决的方法,为今后的分离纯化制备工作提供相关经验。

光伏电池封装材料白色EVA结构稳定性研究

为探究光伏电池封装材料白色乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA)在湿热条件下结构稳定性规律,以实验室层压件模拟光伏电池进行加速环境老化,通过全反射傅立叶红外光谱(ATR-FTIR)定性扫描老化结束后剥离的白色EVA,以反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定白色EVA中游离醋酸/醋酸根(HAc/Ac^(-))含量(以醋酸钠NaAc计)。结果表明,随湿热(DH)老化时间增加,老化后白色EVA产生新的羧基(-COO-)吸收峰(1579cm^(-1)、1435cm^(-1)),白色EVA中游离醋酸/醋酸盐(HAc/Ac^(-))含量也随老化时间增加。白色EVA结构稳定性明显受环境因素影响,且老化过程对促进EVA分解存在明显叠加效应。

反相高效液相色谱法测定Fmoc-L-His(Trt)-OH中光学异构体Fmoc-D-His(Trt)-OH的含量

目的结合外标法和面积归一化法,建立反相高效液相色谱法测定Fmoc-L-His(Trt)-OH中的光学异构体Fmoc-D-His(Trt)-OH的含量。方法采用Chiral MX(2)-RH色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm);以乙腈-水-乙酸(500∶500∶1)为流动相,等度洗脱;流速为0.8 mL·min^(-1);紫外检测器检测,波长为220 nm;柱温为30℃;进样体积为10μL。结果Fmoc-L-His(Trt)-OH和Fmoc-D-His(Trt)-OH分离良好;Fmoc-D-His(Trt)-OH在0.15~2.93 mg·mL^(-1)与峰面积呈良好的线性关系(相关系数为0.9999);定量限为0.15μg·mL^(-1),检测限为0.049μg·mL^(-1)。回收率在95%~100%内,RSD为0.96%。结论本方法操作简单,专属性强,灵敏度高,为Fmoc-L-His(Trt)-OH中光学异构体Fmoc-D-His(Trt)-OH研究提供参考。