长链非编码RNA RP11-321G12.1在乳腺癌中的功能研究

目的研究乳腺癌中雌激素受体调控的长链非编码RNA(lncRNAs)RP11-321G12.1在乳腺癌中的功能及机制。方法前期研究发现RP11-321G12.1是雌激素受体(ER)调控的长链非编码RNA。本研究中,在ER阳性的乳腺癌细胞系MCF7和T47D中,siRNA沉默RP11-321G12.1后,利用平板克隆形成实验和流式细胞术研究RP11-321G12.1对细胞增殖和细胞周期的影响。通过q-PCR和western blot实验研究RP11-321G12.1在乳腺癌中可能参与的分子机制。结果平板克隆实验显示敲低RP11-321G12.1可以抑制显著MCF7的增殖(P=0.003)和T47D的增殖(P=0.001);且可以抑制细胞周期,表现为G1期细胞比值增高和DNA合成的S期细胞比值降低。T47D细胞系的周期阻滞释放实验,发现RP11-321G12.1与细胞周期的G1期成正相关(P=0.039)。western blot实验表明下调RP11-321G12.1可以使G1期相关的周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E2在蛋白水平下降。结论 RP11-321G12.1在ER阳性的乳腺癌组织中高表达。当沉默ER调控的lnc RNAs RP11-321G12.1,可以通过下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1和Cyclin E2的蛋白表达水平,抑制细胞周期进程,使G1期细胞比值增高,S期细胞比值降低,表现为细胞增殖被显著抑制。

RP11-386G11.10在三阴性乳腺癌组织中的表达及其对细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨三阴性乳腺癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)RP11-386G11.10的表达及其通过调控miR-1299-3p/葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)分子轴对三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法:收集46例三阴性乳腺癌组织及癌旁组织,RT-qPCR检测RP11-386G11.10在其中的表达以及在正常乳腺上皮MCF-10A细胞和三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-435、CAL-51、BT-549、MDA-MB-231)中的表达。si-NC慢病毒和si-RP11-386G11.10慢病毒感染BT-549细胞(即si-NC组和si-RP11-386G11.10组),克隆形成实验和细胞划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力;RT-qPCR检测感染后BT-549细胞中miR-1299-3p和GLUT-1 mRNA的表达;双荧光素酶报告基因实验验证RP11-386G11.10与miR-1299-3p的靶向关系。RT-qPCR检测GLUT-1 mRNA在三阴性乳腺癌组织中的表达;Pearson法检测RP11-386G11.10与GLUT-1 mRNA在三阴性乳腺癌组织中表达的关系。免疫印迹检测沉默RP11-386G11.10对BT-549细胞中GLUT-1蛋白以及JAK2/STAT3通路蛋白表达的影响。结果:与癌旁组织相比,三阴性乳腺癌组织中RP11-386G11.10的表达显著升高。与MCF-10A细胞相比,三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-435、CAL-51、BT-549、MDA-MB-231)中RP11-386G11.10的表达均显著升高。与si-NC组BT-549细胞相比,si-RP11-386G11.10组细胞增殖能力和迁移能力均显著降低,miR-1299-3p表达显著升高,GLUT-1mRNA表达显著降低。RP11-386G11.10能够靶向互补结合miR-1299-3p。与癌旁组织相比,三阴性乳腺癌组织中GLUT-1 mRNA表达显著增加;Pearson法分析显示RP11-386G11.10与GLUT-1 mRNA在三阴性乳腺癌组织中的表达呈正相关。与si-NC组BT-549细胞比较,si-RP11-386G11.10组细胞中GLUT-1蛋白表达显著降低,JAK2/STAT3通路转导被抑制。结论:RP11-386G11.10在三阴性乳腺癌中表达显著上调,沉默RP11-386G11.10能够抑制三阴性乳腺癌BT-549细胞的增殖能力和迁移能力,其作用机制可能与靶向调控miR-1299-3p/GLUT-1分子轴有关。

组织RP11-757G1.5水平对胃癌根治术患者预后的评估价值

目的探讨胃癌组织中的长链非编码RNA RP11-757G1.5水平及其预后评估价值。方法采用实时荧光定量PCR检测RP11-757G1.5在98对胃癌组织及对应癌旁组织中的表达差异,基于临床病理资料和随访数据分析RP11-757G1.5的临床价值。结果胃癌组织的RP11-757G1.5水平高于癌旁组织(4.424±0.173 vs.1.686±0.076,t=14.508,P<0.001)。RP11-757G1.5在胃癌组织中表达显著与TNM分期(χ^(2)=7.721,P=0.006)、分化程度(χ^(2)=8.279,P=0.004)、T分期(χ^(2)=5.528,P=0.019)和癌胚抗原状态(χ^(2)=4.125,P=0.042)有关。RP11-757G1.5低表达者的中位无病生存期未达,优于高表达者的38个月(HR=2.714,95%CI:1.613~4.743,P=0.008),经多因素分析证实RP11-757G1.5高表达是胃癌预后不良的危险因素(HR=2.438,95%CI:1.307~4.546,P=0.016)。结论RP11-757G1.5表达上调,是胃癌患者预后不良的预测因子,可能是一个有前途的胃癌生物标志物和治疗靶点。

长链非编码RNA RP11-110G21.1在结肠癌中的表达及其机制研究

目的分析结肠癌组织与癌旁组织中长链非编码RNA RP11-110G21.1(lncRNA RP11-110G21.1)差异表达及其作用机制。方法收集2011年8月-2015年12月上海市松江区中心医院消化外科诊治结肠癌患者120例临床资料,采用qRT-PCR法检测结肠癌及其癌旁组织中lncRNA RP11-110G21.1表达水平,观察lncRNA RP11-110G21.1表达与临床病理特征的关系,分析lncRNA RP11-110G21.1表达对患者预后的影响。采用脂质体Lipofectamin 2000介导的方法将lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor转染结肠癌细胞系LoVo,通过CCK-8法检测下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞迁移、侵袭能力的影响。通过Logistic回归分析影响结肠癌预后危险因素。结果与癌旁组织组比较,结肠癌组lncRNA RP11-110G21.1表达水平显著升高(t=27.868,P=0.000);LoVo细胞转染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后,细胞增殖、迁移、侵袭能力降低(F=85.177,491.168,372.789,P<0.01);lnc RNA RP11-110G21.1在分化程度低、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期患者中表达量高于分化程度中高、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期患者(χ^2/P=4.360/0.035、26.407/0.000);Kaplan-Meier结果显示lncRNA RP11-110G21.1高表达亚组3年内存活率低于低表达亚组(27.6%vs.61.4%,χ^2=13.212,P=0.000);多因素Logistic回归分析显示,TNM分期高、分化程度低、lncRNA RP11-110G21.1高表达是影响结肠癌患者不良预后的危险因素(OR=2.726,2.492,1.576,P均<0.01)。结论结肠癌组织中lncRNA RP11-110G21.1高表达,与患者分化程度、TNM分期及预后有关,降低lncRNA RP11-110G21.1表达可抑制结肠癌增殖、侵袭、迁移能力。

TLR4/NF-κB信号通路激活LncRNA RP11-20G6调控慢性阻塞性肺疾病气道炎症和重塑

目的探讨LncRNA RP11-20G6.3和Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路在调控慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道炎症和重塑中的作用。方法采用野生型(WT)和TLR4基因敲除(KO)C57BL/6雄性小鼠为研究对象,构建COPD模型。采用HE染色和Masson三色染色进行组织学评价;免疫印迹分析TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。通过RNA测序与功能富集分析确定差异表达的LncRNAs,利用RNAhybrid对内源竞争RNA(ceRNA)网络进行预测。结合荧光素酶报告探讨基因之间的关系。结果在COPD模型中,与WT小鼠相比,TLR4-/-小鼠肺组织炎症减弱,肺组织NF-κB相关蛋白表达、BALF中炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)]水平以及Masson三色染色面积降低。RNA测序与功能富集分析确定RP11-20G6.3是差异表达lncRNAs之一,RP11-20G6.3在COPD患者的肺组织中上调,并与FEV1/用力肺活量的比值(FEV1%)相关(ρ=0.549,P=0.047)。RP11-20G6.3质粒干预加重了TLR4-/-COPD小鼠肺组织炎症,以及支气管周围Masson三色面积和BALF中炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平提高。荧光素酶报告基因检测显示,RP11-20G6.3在COPD中充当miR-34c-5p的ceRNA,并通过海绵作用使后者上调Col1a1。结论TLR4/NF-κB将COPD损伤信号传递并激活下游RP11-20G6.3/miR-34c-5p/Col1a1的ceRNA网络触发气道炎症、重塑。

LncRNA RP11-543N12.1与CDH13在老年阿尔茨海默病病人中的表达及其与炎性因子、认知功能的相关性

目的探讨长链非编码RNA RP11-543N12.1(LncRNA RP11-543N12.1)与钙黏蛋白13基因(CDH13)在老年阿尔茨海默病(AD)病人中的表达及其与血清炎性因子、认知功能的相关性。方法选取2016年10月—2019年10月联勤保障部队庐山康复疗养中心收治的120例AD病人为AD组,根据总体衰退量表分为轻度AD组(50例)、中度AD组(39例)、重度AD组(31例),根据简易精神状态量表(MMSE)将AD病人分为轻度认知功能障碍组(60例)、中度认知功能障碍组(40例)、重度认知功能障碍组(20例),同时选取同期体检的健康志愿者70名为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用Addenbrooke认知评估量表第3版(ACE-Ⅲ)、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)、MMSE评分评估病人认知功能。采用Pearson法分析血清RP11-543N12.1、CDH13与血清炎性因子、认知功能评分的相关性。结果AD组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05),轻度AD组、中度AD组、重度AD组RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,AD组血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均明显升高(P<0.05),MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分均明显降低(P<0.05);与轻度认知功能障碍组比较,中度认知功能障碍组与重度认知功能障碍组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。RP11-543N12.1、CDH13与IL-6、IL-8、TNF-α呈正相关(P<0.05),RP11-543N12.1与MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分呈负相关(P<0.05),CDH13与MMSE评分呈负相关(P<0.05)。结论AD病人血清RP11-543N12.1与CDH13表达水平增高,其表达量与炎症反应及认知功能损害密切相关。

长链非编码RNA RP11-395G23.3在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的探讨子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)患者肿瘤组织中长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)RP11-395G23.3的表达水平及其临床意义。方法选取2013年8月—2016年5月复旦大学附属妇产科医院收治的41例子宫内膜癌患者的病理标本并另选26例正常子宫内膜组织标本作为对照组。采用定量RT-PCR的方法检测RP11-395G23.3在EC组织及正常组织中的表达水平,并分析其表达水平与EC临床病理特征以及免疫组化学指标之间的关系。结果EC患者肿瘤组织中RP11-395G23.3表达水平较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。RP11-395G23.3表达水平与EC患者的年龄、组织病理分类、绝经情况、FIGO分期、组织学分级、肌层浸润、淋巴结转移、ER、PR及p53表达水平等均无关(P>0.05)。其表达水平与脉管内癌栓形成以及Ki-67水平差异存在统计学意义(χ^(2)=4.281,P=0.039;χ^(2)=12.060,P=0.002),且RP11-395G23.3与Ki-67表达水平呈负相关(r=-0.379,P=0.014)。结论RP11-395G23.3表达水平与子宫内膜癌组织中的Ki-67表达水平及脉管内癌栓形成密切相关。当脉管内见癌栓或Ki-67高表达时,RP11-395G23.3表达水平降低。RP11-395G23.3有望成为辅助子宫内膜癌诊断及预后的生物标志物。

敲减lncRNA RP11-626G11.3通过调控miR-532-3p抑制人肾癌细胞系的增殖和迁移

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)RP11-626G11.3在肾癌组织和细胞系中的表达,探究敲减RP11-626G11.3对肾癌细胞生物学行为的影响。方法用GEPIA数据库分析RP11-626G11.3在肾癌组织和癌旁组织中的表达情况,用TCGA数据库分析RP11-626G11.3表达水平与肾癌患者生存期的关系。QPCR检测RP11-626G11.3在多种肾癌细胞系中的表达。选择RP11-626G11.3表达最高的肾癌细胞系,分别转染对照质粒(si-NC组)和RP11-626G11.3沉默质粒(si-RP11-626G11.3组)。MTT法和细胞划痕实验检测细胞的增殖和迁移。通过生物信息学方法找到与RP11-626G11.3结合的微小RNA(miRNA),并用双荧光素酶报告实验进行验证。QPCR检测两组细胞中miR-532-3p的表达。Western blot检测两组细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达。结果与癌旁组织相比,肾癌组织中RP11-626G11.3表达量上调(P<0.01)。与RP11-626G11.3高表达的患者相比,RP11-626G11.3低表达的患者生存期较长(P<0.01)。与永生化肾小管上皮细胞相比,肾癌细胞系中RP11-626G11.3表达量均上调(P<0.01),OS-RC-2细胞中RP11-626G11.3的表达量最高(P<0.01)。与si-NC组相比,si-RP11-626G11.3组OS-RC-2细胞活力明显降低(P<0.05),细胞迁移率明显降低(P<0.01)。RP11-626G11.3靶向结合miR-532-3p(P<0.01)。相比si-NC组,si-RP11-626G11.3组OS-RC-2细胞中miR-532-3p表达明显上调(P<0.01),Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Axin2、C-myc、cyclin D1、MMP7表达水平下降。结论RP11-626G11.3在肾癌组织和细胞系中表达量升高,敲减RP11-626G11.3通过调控miR-532-3p表达抑制肾癌细胞系的增殖和迁移。

RP11-273G15.2靶向微小RNA-9-5p对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA RP11-273G15.2靶向调控微小RNA-9-5p(miR-9-5p)表达及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用GEPIA分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中269例肝癌组织和50例正常组织的RP11-273G15.2水平;实时定量PCR(qPCR)检测正常人肝细胞HL-7702和肝癌细胞(SMMC-7721、HepG2和BEL-7404)的RP11-273G15.2水平,构建过表达RP11-273G15.2的pcDNA3.1质粒并采用脂质体转染SMMC-7721细胞(过表达组),同时设未行转染的细胞为空白对照组和转染空载pcDNA3.1质粒的阴性对照组。采用qPCR、噻唑蓝(MTT)比色法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测RP11-273G15.2水平、细胞活力和凋亡率,qPCR和Western blotting检测凋亡相关因子的表达情况,利用LncBase Predicted v.2在线预测RP11-273G15.2可能结合的下游miRNAs并筛选miR-9-5p为研究目标,构建pGL3荧光素酶报告载体并采用双荧光素酶报告分析系统验证RP11-273G15.2对miR-9-5p的结合能力。结果GEPIA分析结果显示,269例肝癌组织的RP11-273G15.2水平低于50例正常组织(P<0.05)。肝癌细胞的RP11-273G15.2水平均低于HL-7702细胞(P<0.05),选取RP11-273G15.2水平最低的SMMC-7721细胞进行后续过表达实验;与其余两组相比,过表达组的RP11-273G15.2水平升高而miR-9-5p水平降低且转染48~72 h的细胞活力减弱(P<0.05)。过表达组的凋亡率为(26.173±3.065)%,均高于空白对照组的(11.567±2.135)%和阴性对照组的(10.136±1.740)%(P<0.05)。与其余两组相比,过表达组的Bcl-2水平降低,而Bax、caspase-3和cleaved caspase-3水平升高(P<0.05)。MiR-9-5p模拟物能抑制转染野生型pGL3质粒的荧光素酶活性(P<0.05),但对突变型质粒无影响(P>0.05)。结论肝癌组织和细胞中RP11-273G15.2低表达且发挥抑癌作用,上调其水平可抑制增殖并诱导凋亡,可能与靶向miR-9-5p有关,RP11-273G15.2/miR-9-5p轴在肝癌治疗中有一定潜能。

阿尔茨海默病细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用

目的探讨阿尔茨海默病(AD)细胞模型中长链非编码RNA(lncRNA)RP11-543N12.1对CDH13的表达调控作用。方法采用基因芯片技术筛选AD相关差异表达lncRNA和mRNA,并通过Real-time PCR技术验证AD细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1和CDH13 mRNA表达均增加,与芯片结果一致;然后将RP11-543N12.1-siRNA转入SH-SY5Y细胞,并加入β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)作用48 h,接着MTT检测细胞存活率,Real-time PCR技术检测RP11-543N12.1和CDH13在RNA水平的变化,Western blotting检测CDH13蛋白表达,Hoechst33258染色检测细胞核的形态学变化,流式细胞术检测凋亡率。结果在未转染RP11-543N12.1-siRNA的SH-SY5Y细胞中,Aβ25-35处理48 h后,与正常细胞相比,细胞存活率降低(P<0.05),CDH13 RNA水平增加(P<0.01),CDH13蛋白活性形式表达量增加(P<0.01),细胞核出现凋亡的形态学变化,流式检测细胞凋亡率增加(P<0.01);转入RP11-543N12.1-siRNA后再用Aβ25-35处理48 h,细胞存活率、CDH13 RNA水平、蛋白活性形式表达量、细胞凋亡率均趋于正常水平,细胞核凋亡的形态学变化消失。结论 LncRNA RP11-543N12.1能够调节CDH13的表达,降低RP11-543N12.1的表达量能使CDH13表达下调。

lnc85通过调节CDC42的表达促进肝癌细胞增殖

目的:探讨长链非编码RNA RP11-85G21.1(lnc85)对肝癌细胞增殖的作用及可能机制。方法:RNA全转录组测序结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)筛选验证肝癌中差异高表达的lnc85;利用lnc85过表达/空载慢病毒感染细胞,构建lnc85过表达肝癌细胞株(OE)和对照细胞(control);RNA下拉实验(RNA pull-down)联合质谱筛选lnc85互作蛋白并进行蛋白免疫印迹(western blotting)验证;MTT实验、细胞克隆形成实验分析lnc85过表达对细胞增殖的影响;生物信息学分析lnc85互作蛋白表达水平及对生存的影响。结果:RNA全转录组测序发现,与对照相比,lnc85在肝癌患者血浆外泌体中明显高表达(P<0.001),RT-qPCR验证lnc85在3种肝癌细胞中显著升高(P<0.01,P<0.001);RNA pull-down联合质谱分析发现CDC42为lnc85的互作蛋白,RT-qPCR证实CDC42水平在肝癌细胞显著升高(P<0.001);且lnc85过表达的肝癌细胞中,CDC42蛋白水平显著上调(P<0.001),细胞增殖能力显著增强(P<0.01);生物信息学分析发现,肝癌患者CDC42的表达水平显著高于健康对照(P<0.001),并随着肿瘤等级的增高而增高;高表达CDC42的肝癌患者预后不良(P<0.001)。结论:lnc85在肝癌中高表达,可能通过靶向调节CDC42的表达促进肝癌细胞的增殖。

绵羊肺炎支原体对人肺泡Ⅱ型上皮细胞活性及炎症反应的影响

为探究绵羊肺炎支原体(MO)是否对人体造成潜在影响,本研究以人肺泡Ⅱ型上皮细胞为细胞模型,将MO Y98株荧光染色后感染人肺泡Ⅱ型上皮细胞,于激光共聚焦显微镜下可见MO存在于细胞中;分别利用CCK-8及CellTiter-LumiTM试剂盒检测细胞的增殖及活力,结果显示MO对人肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖及活性均无显著影响;扫描电镜检测细胞形态,结果显示肺泡上皮细胞伪足明显增多;基因芯片分析筛选出3个mRNA及5个lncRNA,荧光定量PCR验证后确定SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1及lncRNA RP11-29G8.3-001在MO感染后的转录水平发生显著变化;荧光定量PCR检测肺泡上皮细胞中IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7等炎症因子,结果显示这些因子基因的转录水平无明显变化;采用将lncRNA RP11-29G8.3-001过表达的方法对其功能进行研究,结果显示少量lncRNA RP11-29G8.3-001表达增高不会调控细胞免疫相关基因的表达。本研究结果表明MO并不降低人肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖及活性,且MO对人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子的表达无显著影响,提示MO对人肺泡Ⅱ型上皮细胞影响较小。本研究为防范MO对人呼吸系统存在的潜在影响提供了实验依据。

RASGRF1基因遗传多态性与甘肃地区近视易感性的相关性

目的:分析RASGRF1基因顺式调控元件中单核苷酸多态性与甘肃地区近视人群的相关性。方法:系列病例对照研究。选取2018年1月至2019年1月就诊于甘肃省人民医院眼视光学中心的高度近视患者166例(332眼)和中低度近视患者92例(184眼)分别作为高度近视组和中低度近视组,并将77例(154眼)无近视的志愿者作为正常对照组。首先利用"DNA元件百科全书"计划(ENCODE)和基因型组织表达数据库(GTEx)确定眼组织细胞相关功能性调控元件中的5个单核苷酸多态性(SNP),并利用多重连接酶检测反应技术进行候选SNP的基因分型。在不同遗传模式下,采用卡方检验、非条件Logistic回归分析近视患者和正常对照人群的基因型频率分布差异。结果:rs8033417 T/C在显性模式下含等位基因C的个体近视的发病风险明显降低(P=0.035);rs8033417与甘肃地区中低度近视发病风险无相关性,但在显性模式和加性模式下能明显降低高度近视患者的患病风险(P=0.043、0.032)。进一步的生物信息学分析发现,rs8033417 T/C与RASGRF1基因的反义长非编码RNA基因RP11-16K12.1的表达相关。结论:rs8033417可能是甘肃地区近视发生相关的遗传变异位点,推测其可能通过影响反义长非编码RNA基因RP11-16K12.1的表达,继而调控RASGRF1基因表达从而影响近视尤其是高度近视的患病风险。