LncRNA RP11-543N12.1与CDH13在老年阿尔茨海默病病人中的表达及其与炎性因子、认知功能的相关性

目的探讨长链非编码RNA RP11-543N12.1(LncRNA RP11-543N12.1)与钙黏蛋白13基因(CDH13)在老年阿尔茨海默病(AD)病人中的表达及其与血清炎性因子、认知功能的相关性。方法选取2016年10月—2019年10月联勤保障部队庐山康复疗养中心收治的120例AD病人为AD组,根据总体衰退量表分为轻度AD组(50例)、中度AD组(39例)、重度AD组(31例),根据简易精神状态量表(MMSE)将AD病人分为轻度认知功能障碍组(60例)、中度认知功能障碍组(40例)、重度认知功能障碍组(20例),同时选取同期体检的健康志愿者70名为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用Addenbrooke认知评估量表第3版(ACE-Ⅲ)、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)、MMSE评分评估病人认知功能。采用Pearson法分析血清RP11-543N12.1、CDH13与血清炎性因子、认知功能评分的相关性。结果AD组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05),轻度AD组、中度AD组、重度AD组RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,AD组血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均明显升高(P<0.05),MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分均明显降低(P<0.05);与轻度认知功能障碍组比较,中度认知功能障碍组与重度认知功能障碍组血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。RP11-543N12.1、CDH13与IL-6、IL-8、TNF-α呈正相关(P<0.05),RP11-543N12.1与MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA评分呈负相关(P<0.05),CDH13与MMSE评分呈负相关(P<0.05)。结论AD病人血清RP11-543N12.1与CDH13表达水平增高,其表达量与炎症反应及认知功能损害密切相关。

阿尔茨海默病细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用

目的探讨阿尔茨海默病(AD)细胞模型中长链非编码RNA(lncRNA)RP11-543N12.1对CDH13的表达调控作用。方法采用基因芯片技术筛选AD相关差异表达lncRNA和mRNA,并通过Real-time PCR技术验证AD细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1和CDH13 mRNA表达均增加,与芯片结果一致;然后将RP11-543N12.1-siRNA转入SH-SY5Y细胞,并加入β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)作用48 h,接着MTT检测细胞存活率,Real-time PCR技术检测RP11-543N12.1和CDH13在RNA水平的变化,Western blotting检测CDH13蛋白表达,Hoechst33258染色检测细胞核的形态学变化,流式细胞术检测凋亡率。结果在未转染RP11-543N12.1-siRNA的SH-SY5Y细胞中,Aβ25-35处理48 h后,与正常细胞相比,细胞存活率降低(P<0.05),CDH13 RNA水平增加(P<0.01),CDH13蛋白活性形式表达量增加(P<0.01),细胞核出现凋亡的形态学变化,流式检测细胞凋亡率增加(P<0.01);转入RP11-543N12.1-siRNA后再用Aβ25-35处理48 h,细胞存活率、CDH13 RNA水平、蛋白活性形式表达量、细胞凋亡率均趋于正常水平,细胞核凋亡的形态学变化消失。结论 LncRNA RP11-543N12.1能够调节CDH13的表达,降低RP11-543N12.1的表达量能使CDH13表达下调。

长链非编码RNA RP11-321G12.1在乳腺癌中的功能研究

目的研究乳腺癌中雌激素受体调控的长链非编码RNA(lncRNAs)RP11-321G12.1在乳腺癌中的功能及机制。方法前期研究发现RP11-321G12.1是雌激素受体(ER)调控的长链非编码RNA。本研究中,在ER阳性的乳腺癌细胞系MCF7和T47D中,siRNA沉默RP11-321G12.1后,利用平板克隆形成实验和流式细胞术研究RP11-321G12.1对细胞增殖和细胞周期的影响。通过q-PCR和western blot实验研究RP11-321G12.1在乳腺癌中可能参与的分子机制。结果平板克隆实验显示敲低RP11-321G12.1可以抑制显著MCF7的增殖(P=0.003)和T47D的增殖(P=0.001);且可以抑制细胞周期,表现为G1期细胞比值增高和DNA合成的S期细胞比值降低。T47D细胞系的周期阻滞释放实验,发现RP11-321G12.1与细胞周期的G1期成正相关(P=0.039)。western blot实验表明下调RP11-321G12.1可以使G1期相关的周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E2在蛋白水平下降。结论 RP11-321G12.1在ER阳性的乳腺癌组织中高表达。当沉默ER调控的lnc RNAs RP11-321G12.1,可以通过下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1和Cyclin E2的蛋白表达水平,抑制细胞周期进程,使G1期细胞比值增高,S期细胞比值降低,表现为细胞增殖被显著抑制。

长链非编码RNA RP11-739N20.2对肺癌细胞增殖和侵袭迁移的影响

目的探讨长链非编码RNA RP11-739N20.2对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和侵袭迁移的影响。方法采用实时定量PCR(qPCR)检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞(NCI-H1975、NCI-H1299、NCI-H157和A549)的RP11-739N20.2水平;脂质体法向A549细胞转染3条靶向RP11-739N20.2的小干扰RNA(siRNA)及阴性对照序列(si-NC)后经qPCR筛选干扰效果最显著的siRNA片段进行功能实验。根据转染情况将A549细胞分为转染siRNA片段的干扰组、转染si-NC的阴性对照(NC)组和未转染的空白对照(Blank)组,活细胞计数(CCK-8)法、划痕实验和Transwell小室实验检测细胞活力、划痕愈合率和穿膜细胞数以评估增殖和迁移侵袭能力,Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、β-catenin和wnt-1的水平。结果NSCLC细胞的RP11-739N20.2水平均高于BEAS-2B细胞(P<0.05),选取RP11-739N20.2水平最高的A549细胞进行后续的干扰实验;A549细胞转染siRNA-1~3后的RP11-739N20.2水平均低于转染si-NC的细胞及未转染细胞(P<0.05),选取RP11-739N20.2水平最低的siRNA-1片段进行后续功能实验。干扰组的RP11-739N20.2水平、划痕愈合率和穿膜细胞数分别为0.354±0.022、(33.179±3.635)%和(96.597±11.031)个,均低于Blank组的1.021±0.027、(66.396±3.723)%和(187.473±17.116)个及NC组的1.036±0.037、(62.025±4.334)%和(182.952±19.593)个,差异有统计学意义(P<0.05)。与Blank组和NC组相比,干扰组A549细胞的MMP-2、MMP-9、β-catenin和wnt-1的水平降低(P<0.05);Blank组和NC组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。结论NSCLC细胞中RP11-739N20.2高表达且发挥促癌作用,通过RNA干扰下调其水平可导致增殖和侵袭迁移能力减弱,可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

m^(6)A修饰调控RP11-426A6.5在喉鳞状细胞癌中的作用及机制研究

目的探究N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m^(6)A)修饰调控RP11-426A6.5在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)发生与发展过程中的作用机制。方法收集2017年1月至9月哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科收治的48例LSCC患者的癌及癌旁组织,选取其中3例LSCC样本利用长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)m^(6)A甲基化芯片及表达谱芯片技术检测lncRNAs的甲基化和表达水平并筛选关键lncRNA。通过甲基化RNA免疫共沉淀-定量PCR(methylated RNA immunoprecipitation-quantitative PCR,MeRIP-qPCR)及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)在其余45例LSCC样本中验证RP11-426A6.5的m^(6)A修饰和表达水平,并分析RP11-426A6.5与肿瘤恶性程度、预后等临床因素间的相关性。在体外,运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术构建低表达RP11-426A6.5喉癌细胞系,以EdU细胞增殖检测实验、伤口愈合实验、Transwell侵袭实验分别观察LSCC细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学功能变化,以裸鼠成瘤实验验证RP11-426A6.5下调后对体内移植瘤生长的影响。应用TCGA数据库及SRAMP网站预测介导RP11-426A6.5 m^(6)A修饰的相关酶及相应甲基化位点,选用MazF酶切法对结合位点验证。运用RNAi技术在细胞水平干扰修饰酶相应基因表达后观察细胞功能的改变并利用MeRIP-qPCR检测RP11-426A6.5 m^(6)A水平变化,以放射线菌素D处理细胞系观察RP11-426A6.5稳定性改变。结果LSCC组织中RP11-426A6.5甲基化及表达水平明显高于癌旁组织[RP11-426A6.5甲基化水平:癌组织(23.828±4.975)比癌旁组织(20.280±3.607),RP11-426A6.5表达水平:癌组织(1.197±0.314)比癌旁组织(1.015±0.170),P值均<0.05],且RP11-426A6.5表达水平与肿瘤大小(T期)密切相关[T1-2期(1.081±0.298)比T3-4期(1.306±0.292),χ2=5.35,P<0.05]。RP11-426A6.5高表达患者的术后生存期明显低于低表达组患者,差异有统计学意义(P=0.046)。体内外试验结果显示下调RP11-426A6.5后LSCC细胞增殖、迁移、侵袭能力显著下降且移植瘤生长受到明显抑制。m^(6)A修饰酶中甲基化转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)与RP11-426A6.5相应甲基化位点结合增强其稳定性并介导其对LSCC细胞恶性行为的调控。结论RP11-426A6.5能够调控LSCC细胞的恶性行为并受到甲基转移酶METTL3所参与的m^(6)A修饰过程调控。

RASGRF1基因遗传多态性与甘肃地区近视易感性的相关性

目的:分析RASGRF1基因顺式调控元件中单核苷酸多态性与甘肃地区近视人群的相关性。方法:系列病例对照研究。选取2018年1月至2019年1月就诊于甘肃省人民医院眼视光学中心的高度近视患者166例(332眼)和中低度近视患者92例(184眼)分别作为高度近视组和中低度近视组,并将77例(154眼)无近视的志愿者作为正常对照组。首先利用"DNA元件百科全书"计划(ENCODE)和基因型组织表达数据库(GTEx)确定眼组织细胞相关功能性调控元件中的5个单核苷酸多态性(SNP),并利用多重连接酶检测反应技术进行候选SNP的基因分型。在不同遗传模式下,采用卡方检验、非条件Logistic回归分析近视患者和正常对照人群的基因型频率分布差异。结果:rs8033417 T/C在显性模式下含等位基因C的个体近视的发病风险明显降低(P=0.035);rs8033417与甘肃地区中低度近视发病风险无相关性,但在显性模式和加性模式下能明显降低高度近视患者的患病风险(P=0.043、0.032)。进一步的生物信息学分析发现,rs8033417 T/C与RASGRF1基因的反义长非编码RNA基因RP11-16K12.1的表达相关。结论:rs8033417可能是甘肃地区近视发生相关的遗传变异位点,推测其可能通过影响反义长非编码RNA基因RP11-16K12.1的表达,继而调控RASGRF1基因表达从而影响近视尤其是高度近视的患病风险。