RMP通过AMPK通路调节线粒体稳态和氧化应激诱导卵巢癌细胞增殖与凋亡的机制研究

目的探讨RPB5调节蛋白(RPB5-mediating protein,RMP)对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响以及通过腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)通路调节线粒体稳态和氧化应激的作用机制。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测人输卵管上皮永生化细胞FTE-187与人卵巢癌细胞系SKOV3,A2780和HO8910中RMP基因的表达。以SKOV3细胞作为研究对象,利用siRNA技术敲低SKOV3细胞中RMP的表达,再通过qRT-PCR法验证RNAi效率。通过平板克隆形成实验和流式细胞技术观察敲低RMP表达后对SKOV3细胞增殖能力、周期分布及凋亡能力的影响。通过激光共聚焦显微镜观察敲低RMP表达后SKOV3细胞中线粒体形态的变化。Western blot进一步证实RMP调控线粒体稳态相关蛋白AMPK和p-AMPK以及凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。采用ROS荧光法检测敲低RMP表达后对SKOV3细胞内ROS水平的影响。结果RMP在FTE-187细胞中的表达水平为1.00±0.13,在A2780,HO8910和SKOV3细胞中的表达水平分别为1.58±0.19,1.88±0.17,2.15±0.10,较FTE-187中的表达显著上升,差异有统计学意义(F=72.035,P<0.001)。SKOV3细胞转染后,RMP-siR组RMP表达水平为0.86±0.20,较control组(2.06±0.11)和NC-siR组(1.92±0.23)显著下降,差异有统计学意义(F=90.220,P<0.001)。平板克隆形成实验和流式细胞检测结果表明,敲低RMP可以通过引起G2/M期阻滞导致卵巢癌细胞增殖障碍,促进卵巢癌细胞凋亡。通过激光共聚焦显微镜观察到敲低RMP表达后,SKOV3细胞中点状的线粒体明显增多,线粒体的碎片化也增多,导致线粒体稳态失衡。Western blot结果表明,control组和NC-siR组p-AMPK表达水平分别为0.75±0.12,0.77±0.17,敲低RMP表达后,p-AMPK表达水平为1.39±0.33,较control组和NC-siR组升高,差异有统计学意义(F=46.550,P<0.001)。control组和NC-siR组凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值分别为0.55±0.11和0.56±0.08,敲低RMP表达后,Bax/Bcl-2比值增加为1.57±0.22,差异亦有统计学意义(F=62.027,P<0.001)。荧光显微镜观察到,control组和NC-siR组荧光强度分别为100.24%±8.76%和103.07%±7.93%,敲低RMP后其荧光强度为295.14%±12.10%,显著高于control组和NC-siR组,差异有统计学意义(F=392.708,P<0.001)。结论RMP在卵巢癌细胞中呈高表达,敲低RMP表达后可以通过激活磷酸化AMPK通路导致卵巢癌细胞线粒体稳态失衡和氧化应激,诱导卵巢癌细胞在G2/M期发生阻滞,进而抑制卵巢癌细胞增殖,促进其凋亡。

RMP基因沉默对肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响

目的:建立RMP(RPB5-mediating protein)基因沉默的稳定细胞株,研究RMP小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移的抑制作用。方法:首先,体外合成3条RMP基因的siRNA,并转染到SMMC-7721细胞中,RT-PCR检测3条siRNA对RMP基因表达的抑制作用,筛选出最佳干扰序列;然后,pGPU6-Neo-RMP-484真核表达载体转染,G418筛选出稳定干扰RMP基因的细胞株,RT-PCR法检测该稳定细胞株中RMP基因的干扰效率,MTT法检测RMP-siRNA对SMMC-7721细胞增殖及细胞黏附能力的影响,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:利用RNA干扰技术成功建立了RMP基因下调的稳定细胞株,与SMMC-7721细胞对照组比较,其RMP mRNA表达水平下调了(83.67±2.56)%。稳定转染siRNA的细胞株细胞增殖受到抑制,增殖抑制率可达(74.33±0.58)%。稳定转染细胞株的细胞黏附能力有所增加,迁移率则相应降低。结论:成功筛选出了稳定转染RMP-siRNA重组载体的细胞株。pGPU6-Neo-RMP-484重组载体能有效抑制RMP基因在肝癌SMMC-7721细胞内的表达,可作为RMP分子机制研究的细胞模型。RMP基因的下调能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,使其黏附率增加,同时细胞的迁移率降低。

RMP基因的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的制备RPB5调节蛋白(RMP)抗体并研究RMP在60Coγ射线诱导的SMMC-7721肝癌细胞凋亡过程中的表达及功能。方法 RT-PCR检测HT-29、A549、Hep-2、SGC-7901、293T、HeLa、WI-38和SMMC-7721细胞株中RMP的表达;从质粒中PCR扩增得到人RMP基因并克隆至原核表达载体中,诱导表达后经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-RMP/D1,以该蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体;肝癌细胞SMMC-TT21、PFlaG-CMV4-SMMC-7721、PFlaG-CMV4-RMP-SMMC-7721经6 Gy 60 Coγ射线照射后,流式细胞术检测肝癌细胞凋亡的变化。结果RMP在以上细胞系中均有表达,但程度不同;SDS-PAGE鉴定示纯化蛋白为目的蛋白人RMP片段。Western blot结果显示,制备的多抗可与RMP蛋白特异性结合;肝癌细胞株经6 Gy 60Coγ射线照射后,流式细胞术结果表明RMP使肝癌细胞SMMC-7721的凋亡减少。结论 RMP在不同细胞株中均有表达且能减少肝癌细胞SMMC-7727的凋亡,为RMP用于肝癌的基因治疗奠定了基础。