应用荧光定量PCR方法研究RPL29基因在通城猪和长白猪不同时期胚胎骨骼肌中的表达

为了研究蛋白合成相关基因RPL29在骨骼肌发育中的作用，采用SYBRGreen染料建立该基因的实时荧光定量PCR（QPCR）分析方法，并分析该基因在猪胚胎骨骼肌中的表达变化。以不同浓度稀释样本为标准品，建立标准曲线方程：y=-3.303X＋43．077（决定系数R^2=0．999）。分析表明：该方法具有较大的检验范围（PCR扩增Q值13～35），很好的扩增效率为100％，熔解曲线显示产物特异的单峰，其Tm值为86．5℃。本研究以H3F3A基因为内参，用所建立的实时定量PCR方法，分析RPL29在妊娠33、65和90d的通城猪和长白猪胚胎骨骼肌中的表达变化。研究发现：RPL29基因在通城猪和长白猪胚胎骨骼肌发育过程中分别呈现下调和上调表达模式；妊娠33d时，通城猪中的表达水平高于长白，而妊娠90d时在长白猪中高表达；妊娠65d时两品种间无显著差异。结果显示RPL29基因可能与猪骨骼肌的生长发育有关，并可能影响产肉性状。

RPL29和RANKL表达与牙龈癌发生、进展及预后的相关性

目的研究核糖体蛋白L29(RPL29)和核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)表达与牙龈癌发生、进展及预后的相关性。方法选取87例牙龈癌患者作为研究对象,检测肿瘤组织和癌旁正常组织RPL29和RANKL表达阳性率,分析RPL29和RANKL在不同性别、年龄、饮酒史、吸烟史、临床分期、病理分级以及是否存在淋巴结转移的组织中的水平,对比RPL29和RANKL不同表达水平患者的平均预后生存时间。结果肿瘤组织RPL29阳性表达率为71.26%(62/87)、RANKL阳性表达率为72.41%(63/87),均显著高于癌旁正常组织的12.64%(11/87)和13.79%(12/87)(P<0.05)。RPL29和RANKL的阳性表达在TNMⅢ~Ⅳ期和存在淋巴结转移的组织中明显高于TNMⅠ~Ⅱ期和不存在淋巴结转移的组织(P<0.05)。随着RPL29和RANKL表达水平的升高,患者的平均预后生存时间随之降低(P<0.05)。结论RPL29和RANKL表达在牙龈癌发生和进展中发挥着重要的作用,同时与患者的预后生存时间具有一定的相关性。

山羊RPL29基因克隆和序列分析及其对肌内脂肪细胞脂质生成的影响

本研究旨在克隆简州大耳羊RPL29基因并分析其分子特性及对肌内脂肪细胞脂质生成的影响。利用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法克隆山羊RPL29基因序列,用生物信息学方法分析该基因序列特征,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测其在山羊各种组织和不同分化阶段肌内脂肪细胞中的mRNA表达水平。利用基因重组法构建的pEGFP-N1-RPL29过表达载体转染进山羊肌内前体脂肪细胞并诱导分化,用油红O和Bodipy染色方法从形态学上揭示过表达RPL29对脂滴积聚的影响,用qRT-PCR检测脂代谢相关基因表达水平的变化。结果显示,山羊RPL29长为507 bp,其中氨基酸编码区(coding sequence,CDS)为471 bp,编码156个氨基酸,是一种主要分布在细胞核、带正电荷且较稳定的亲水性蛋白质。组织表达谱表明该基因在山羊皮下脂肪组织及腹部脂肪组织中的表达水平显著高于其他组织(P<0.05)。时序表达谱表明该基因在山羊肌内脂肪细胞分化第84小时表达水平最高,极显著高于未分化时期(P<0.01)。过表达RPL29促进山羊肌内脂肪细胞中的脂质积聚,且油红O染色后OD值显著增加(P<0.05)。此外,过表达RPL29基因后ATGL和ACC基因表达量极显著增加(P<0.01),FASN基因的表达量显著增加(P<0.05)。总之,山羊RPL29基因可能通过上调FASN、ACC和ATGL来促进山羊肌内脂肪细胞脂质沉积。

花生核糖体蛋白L29-1(RPL29-1)基因克隆表达分析及载体构建

核糖体蛋白是核糖体的主要组成成分,在细胞内蛋白质生物合成过程中具有重要作用。RPL29-1是核糖体大亚基60S的一个组件。本研究以花生品种日花1号为材料,利用RACE方法成功得到RPL29-1基因的c DNA序列,并获得DNA序列。RPL29-1基因c DNA序列包括186 bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。RPL29-1基因DNA序列含有两个外显子和一个内含子。一级结构分析表明,RPL29-1蛋白质分子量为7 127.02 Da,等电点为10.29。本研究采用荧光定量技术(q RT-PCR)分析了RPL29-1基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了RPL29-1的过表达载体和反义表达载体,为进一步通过功能分析研究花生RPL29-1基因在抗青枯病中的作用奠定基础。

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

目的通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法将诱饵质粒p GBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体p CMV-Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull-down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果诱饵质粒p GBKT7-LCMR1与95D细胞c DNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载p CMV-Myc-LCMR1、pc DNA3.0-flag-RPL29及pc DNA3.0-flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。

核糖体蛋白L29在牙龈鳞状细胞癌中表达的临床病理意义

目的研究核糖体蛋白L29(RPL29)在人牙龈鳞状细胞癌(GSCC)中的表达及其临床病理意义。方法青岛大学附属医院口腔颌面外科GSCC 50例,收集肿瘤组织、癌旁组织及正常牙龈组织,应用SP免疫组化法检测RPL29蛋白的表达情况,分析RPL29在GSCC的不同临床T分期、病理分级、有无淋巴结转移以及患者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史之间表达的差异,探讨其临床病理意义。结果 RPL29在GSCC中的阳性表达率为66.67%,明显高于癌旁组织的19.05%,且在正常牙龈组织中不表达(阳性率0%),其表达有显著差异(P<0.05)。RPL29的阳性表达分别与GSCC的不同临床T分期及病理分级之间在统计学上无明显差异。RPL29在T1、T2、T3+T4中的阳性率分别为81.82%(9/11)、86.67%(26/30)、66.67%(6/9),统计学无明显差异(P>0.05)。高分化GSCC(36例)与较低分化GSCC(14例)中的RPL29阳性率分别为77.78%(28/36)、92.86%(13/14),无明显差异(P>0.05)。有淋巴结转移者RPL29阳性率100%(15/15),无淋巴结转移者阳性率74.29%(26/35),RPL29的表达在患者有无淋巴结转移组间存在明显差异,且差异有统计学意义(P<0.05)。RPL29表达在不同年龄段、不同性别、有无吸烟、饮酒史等独立分组中无显著差异(P>0.05)。结论 RPL29在牙龈癌中高表达,其表达水平与GSCC患者有无淋巴结转移之间差异显著,对于牙龈癌的转移及预后判断有重要临床病理意义。