花生核糖体蛋白L29-1(RPL29-1)基因克隆表达分析及载体构建

核糖体蛋白是核糖体的主要组成成分,在细胞内蛋白质生物合成过程中具有重要作用。RPL29-1是核糖体大亚基60S的一个组件。本研究以花生品种日花1号为材料,利用RACE方法成功得到RPL29-1基因的c DNA序列,并获得DNA序列。RPL29-1基因c DNA序列包括186 bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。RPL29-1基因DNA序列含有两个外显子和一个内含子。一级结构分析表明,RPL29-1蛋白质分子量为7 127.02 Da,等电点为10.29。本研究采用荧光定量技术(q RT-PCR)分析了RPL29-1基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了RPL29-1的过表达载体和反义表达载体,为进一步通过功能分析研究花生RPL29-1基因在抗青枯病中的作用奠定基础。

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

目的通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法将诱饵质粒p GBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体p CMV-Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull-down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果诱饵质粒p GBKT7-LCMR1与95D细胞c DNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载p CMV-Myc-LCMR1、pc DNA3.0-flag-RPL29及pc DNA3.0-flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。