大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.

纯红细胞再生障碍性贫血临床特点与RPS19、RPL5、RPL11基因突变之多中心研究

目的通过对纯红细胞再生障碍性贫血的临床回顾与RPS19、RPL5、RPL11基因突变的检测,分析比较先天性纯红细胞再生障碍性贫血与获得性纯红细胞再生障碍性贫血的临床异同和RPS19、RPL5和RPL11基因突变情况。方法 20例来自多中心的儿童纯红细胞再生障碍性贫血,先天性14例,获得性6例,分析临床资料并比较两组发病年龄、外周血细胞计数和对治疗的反应。Sanger双脱氧链终止法对患儿RPS19、RPL5和RPL11基因测序。结果先天性纯红细胞再生障碍性贫血42.8%伴有先天畸形,与获得性纯红细胞再生障碍性贫血比较,网织红细胞较低(P<0.05),外周血WBC、HGB和PLT无差异。激素治疗有效率分别是:先天性78.6%、获得性100%(P<0.05)。先天性纯红再障7.1%检出RPS19点突变,获得性纯红再障未发现RPS19突变。先天性纯红再障和获得性纯红再障RPL5和RPL11基因均未发现突变。结论先天性纯红再障42.8%合并畸形,网织红细胞均低于获得性纯红再障,RPS19突变率低于国外文献报道。RPS19突变可能与先天性纯红再障有关。获得性纯红再障发病与RPS19、RPL5和RPL11基因异常可能无关。

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。

RPL5蛋白重组质粒的构建、表达及细胞内定位

目的构建重组质粒载体pc DNA3.1-RPL5,观察核糖体蛋白L5(RPL5)在293T、Hep G2和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况。方法使用基因合成法合成RPL5基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,扩增后的目的基因双酶切后连接至pc DNA3.1载体的Bam HⅠ和NotⅠ位点之间,从而构建重组质粒pc DNA3.1-RPL5。将后者转化DH5α大肠杆菌,培养后挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳、测序比对等鉴定。采用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转染至293T、Hep G2和SMMC7721细胞株,激光共聚焦显微镜观察RPL5在此3种细胞中的表达和定位情况。结果重组质粒pc DNA3.1-RPL5经酶切电泳及DNA测序比对证实,目的基因RPL5的序列完全正确,重组质粒载体构建成功。激光共聚焦观察发现RPL5主要表达于293T、Hep G2和SMMC7721细胞的胞质中。结论成功构建pc DNA3.1-RPL5融合基因并在293T、Hep G2和SMMC7721细胞中表达,证实RPL5主要表达在真核细胞的细胞质中,为进一步探讨RPL5的生物学功能奠定了基础。

RPL5基因突变致先天性纯红细胞再生障碍性贫血1例并文献复习

目的探讨儿童RPL5基因突变致先天性纯红细胞再生障碍性贫血(DBA)的临床特征,以期提高临床医师对该病的认识。方法对复旦大学附属儿科医院收治的1例RPL5基因突变致DBA患儿的临床资料和测序结果进行分析,并检索国内外文献,总结该病的临床特征。结果患儿,男,8岁。骨髓穿刺检查提示DBA,基因检测显示其RPL5基因杂合突变:c.657 C>G,p.Y219X,该突变类型为国内外首次报道。数据库共检索到该病47例,其临床特征显示(包括本研究1例,共48例):该病的男女比例发病率相同;亚洲地区患者数量低于欧美地区;散发为主;欧美地区外显子突变中,43.0%集中在Exon3;RPL5突变的DBA患者畸形率达81.3%(39/48例,不包括身材矮小),高于其他突变类型患者,其糖皮质激素治疗有效率为46.0%,低于DBA患者整体激素治疗反应率。结论chr1:93303142(c.657 C>G,p.Y219X)是RPL5基因的新突变,可导致DBA,拓展了该病的致病基因谱。RPL5突变患者致畸率与多重致畸率较高,且激素治疗反应率较低。

先天性纯红细胞再生障碍性贫血的临床及基因特点

目的探讨先天性纯红细胞再生障碍性贫血(DBA)的临床及致病基因特点。方法回顾性分析2例DBA患儿的临床及致病基因特点,并进行文献复习。结果 2例患者(2~3个月的婴儿)均呈慢性重度正细胞正色素贫血,不伴白细胞及血小板计数异常,网织红细胞计数均降低,血清铁、血清铁蛋白轻度升高,骨髓细胞学提示红细胞比例明显降低、幼红减少或缺如,1例DBA致病基因检测发现已报道的RPS19基因致病性杂合突变:c.212G>A(p.Gly71Glu),其父母未见突变;另1患儿检测到新的RPL5基因杂合突变:c.740T>C(p.I247L),其父母未见突变,生物信息学分析该突变可能致病。结论 DBA患儿多在婴儿早期发病,以红系缺乏为表现,编码核糖体亚基蛋白的基因突变为常见病因,进行分子检测有利于DBA早期诊断。