土木香内酯对RPMI-8226细胞的增殖抑制作用及其相关机制研究

目的:探讨土木香内酯(alantolactone)对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:使用浓度为1、2.5、5、7.5及10μmol/L的土木香内酯处理RPMI-8226细胞48 h,应用CCK-8检测细胞活力,并计算其半数抑制浓度(IC50)值;使用浓度为2.5,5及7.5μmol/L的土木香内酯处理RPMI-8226细胞48 h后,应用AnnexinV/PI双标记法分析细胞凋亡;Western blot方法检测呈切割的caspase-3及ERK信号通路的变化;裸鼠荷瘤并给予土木香内酯以进一步验证其对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡作用。结果:土木香内酯可抑制RPMI-8226细胞活力,并呈现剂量依赖效应(r=-0.9784,P=0.0007);RPMI-8226细胞48 h的IC50为4.32±0.15μmol/L;流式细胞术分析凋亡结果显示,随着土木香内酯浓度的增高,细胞早期凋亡率显著增加(r=0.9601,P<0.05);Western blot结果显示,土木香内酯处理RPMI-8226细胞后,活化了caspase-3,降低ERK磷酸化水平;体内结果显示,给药组小鼠瘤体积明显小于对照组(P<0.05);免疫组织化学检测结果显示,与对照组相比,实验组瘤内细胞核增殖相关抗原Ki67及p-ERK的水平降低。结论:土木香内酯可有效地抑制多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能是通过抑制ERK信号通路的活性,抑制裸鼠皮下多发性骨髓瘤的生长。

蛇床子素诱导人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞凋亡及其机制研究

目的:研究蛇床子素(Osthole)的抗骨髓瘤作用,并探讨其抗骨髓瘤的作用机制。方法:处于对数增殖期人多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226随机分为空白对照组及10、20、40、80、120、160和200μmol/L Osthole组,用MTT法检测细胞增殖率,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白表达量。结果:细胞培养24、48和72h后,不同浓度Osthole组细胞增殖数显著低于空白对照组,且作用呈剂量依赖性。不同浓度Osthole组细胞凋亡相关蛋白PARP被切割明显高于对照组,p53蛋白的表达量明显高于对照组,抗凋亡蛋白Mcl-1表达明显下降。结论:Osthole能明显抑制人多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226细胞增殖,分子机制可能是诱导其细胞凋亡,其诱导凋亡的机制有待于进一步深入研究。

衣霉素对RPMI-8226细胞分化的影响

目的:探讨衣霉素对RPMI-8226细胞分化的机制。方法:用衣霉素处理RPMI-8226细胞。APAAP法测定细胞表面CD49e的表达率;ELISA法测定培养上清液中免疫球蛋白轻链的变化,Western blot法检测XBP-1u蛋白表达水平。结果:衣霉素处理后RPMI-8226细胞表面CD49e表达率增高,细胞培养上清液中的免疫球蛋白量增高,XBP-1u蛋白表达上调。结论:衣霉素可使RPMI-8226细胞向成熟阶段分化。

BECN1表达对人骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、侵袭的影响

目的:探讨BECN1表达对人多发性骨髓瘤(MM)细胞RPMI-8226增殖、侵袭的影响。方法:体外培养RPMI-8226细胞,构建重组质粒pcDNA3.1-BECN1,并转染至RPMI-8226细胞,将细胞分为对照组、阴性转染组、BECN1转染组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞中BECN1mRNA的表达;CCK-8法检测过表达BECN1对各组细胞增殖抑制率的影响;平板克隆法检测过表达BECN1对各组细胞克隆形成率的影响;Transwell实验检测过表达BECN1对各组细胞侵袭的影响;蛋白免疫印迹法检测过表达BECN1对各组细胞增殖、侵袭、自噬相关蛋白表达的影响。结果:BECN1转染组细胞BECN1mRNA的表达显著高于对照组和阴性转染组(P<0.05);BECN1转染组细胞增殖抑制率及细胞自噬蛋白Beclin1和Atg5、侵袭蛋白E-cadherin的表达显著高于对照组和阴性转染组,而细胞克隆形成率、侵袭数目及细胞增殖蛋白CyclinD1、β-catenin、侵袭蛋白N-cadherin表达显著低于对照组和阴性转染组(P<0.05)。结论:过表达BECN1能够抑制人MM细胞RPMI-8226的增殖和侵袭,可能是MM的潜在研究靶点。

基于网络药理学、分子对接及细胞实验验证探讨二至丸治疗多发性骨髓瘤的作用机制

【目的】基于网络药理学、分子对接及细胞实验验证探讨二至丸治疗多发性骨髓瘤(MM)的潜在作用机制。【方法】应用网络药理学、分子对接筛选药物-疾病-靶标-通路关键指标。培养多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226,给予二至丸干预,采用膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)染色法检测细胞凋亡,Transwell实验测定细胞侵袭能力,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测蛋白激酶B(Akt)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、c-MycmRNA表达,Western Blot法检测细胞Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、CCND1、c-Myc、GSK-3β、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)蛋白表达。【结果】获得二至丸14个有效成分。二至丸治疗MM涉及靶点142个,通路富集分析结果显示关键靶点可能主要集中在癌症通路、脂质与动脉粥样硬化等。分子对接结果显示,木樨草素和槲皮素与GSK-3β有较好的结合活性及稳定性。进一步细胞实验验证发现,与空白组比较,二至丸低、中、高剂量组细胞凋亡率显著升高,细胞侵袭数减少,GSK-3β的mRNA和蛋白水平显著升高,CCND1、Akt和c-Myc的mRNA和蛋白水平显著降低,呈剂量依赖性,其中,中、高剂量组差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。【结论】二至丸对MM的治疗作用可能是通过木犀草素和槲皮素等关键活性成分,促进GSK-3β表达,并抑制Akt/GSK-3β/CCND1/c-Myc信号通路来实现的。

雷公藤内酯酮对来那度胺原发耐药RPMI-8226细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨雷公藤内酯酮对来那度胺原发耐药RPMI-8226细胞增殖及凋亡的影响。方法MTS比色法检测来那度胺和雷公藤内酯酮对不同多发性骨髓瘤细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测雷公藤内酯酮对RPMI-8226细胞周期与凋亡的影响;Western blot法检测雷公藤内酯酮对RPMI-8226细胞内IKAROS家族锌指蛋白1(IKZF1)和IKAROS家族锌指蛋白3(IKZF3)表达的影响;RT-qPCR法检测雷公藤内酯酮对RPMI-8226细胞内IKZF1、IKZF3基因转录水平的影响。结果来那度胺对不同类型多发性骨髓瘤细胞增殖的作用强度不同,而雷公藤内酯酮对不同类型多发性骨髓瘤细胞增殖均有强效抑制作用,同时可促进来那度胺非敏感的RPMI-8226细胞凋亡,而对细胞周期变化基本无影响。相较于来那度胺,雷公藤内酯酮可剂量依赖性下调RPMI-8226细胞内IKZF1和IKZF3蛋白的表达,进一步RT-qPCR检测显示,雷公藤内酯酮可降低RPMI-8226细胞IKZF1和IKZF3基因的转录水平。结论雷公藤内酯酮可促进来那度胺原发耐药RPMI-8226细胞的凋亡,并且可通过降低来那度胺原发耐药RPMI-8226细胞内IKZF1和IKZF3基因的转录水平来下调相关蛋白的表达,实现对细胞的增殖抑制作用。

RPMI1640,DMEM及不同生长因子对大鼠颌下腺细胞生长作用的观察

目的 观察RPMI 16 4 0、DMEM及不同生长因子对大鼠颌下腺细胞增殖能力的影响 ,探讨最有利于大鼠颌下腺细胞的培养方法。方法 在RPMI 16 4 0或DMEM培养基中分别加入一定浓度的FBS(胎牛血清 )、EGF(表皮生长因子 )、HC(氢化可地松 )、INS(胰岛素 ) ,观察纤维细胞和腺细胞在不同培养基中的增殖能力。结果 在含5 %FBS、10ng/mlEGF、5 μg/mlHC、5 μg/mlINS的DMEM培养基中 ,上皮细胞生长良好 ,在只含血清的RPMI 16 4 0培养基中 ,纤维细胞生长旺盛 ,上皮样细胞生长不良 ,在不含血清的培养基中所有细胞均生长缓慢。结论 含有 5 %血清、10ng/mlEGF、5 μg/mlHC及 5

猪附红细胞体体外培养体系的初步探讨

为了建立稳定可靠、简单易行、成本低廉的猪附红细胞体体外培养方法,从RPMI-1640、D-MEM、M-199 3种培养液中筛选出效果最好的基础培养基。在筛选出的基础培养基中分别添加20%、30%、40%的猪血清,筛选出培养效果最好的血清浓度。结果表明:以RPMI-1640基础培养基中添加40%的猪血清,在37℃5%的CO2环境下体外培养效果最好。该培养方法的建立,可为猪附红细胞体生物学特性以及药物防治等奠定基础。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合古曲霉素A对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞增殖、凋亡及DLC-1基因表达的影响(英文)

本研究旨在探讨DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)联合组蛋白去乙酰化抑制剂古曲霉素A(TSA)对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞的生物学活性及DLC-1基因表达调控的影响。5-Aza-CdR及TSA单独或联合作用于RPMI 8226细胞系,用CCK-8法检测细胞增殖活性,实时定量PCR(RT-PCR)检测药物作用后DLC-1基因表达情况,ELISA检测药物作用后RhoA及Rac1蛋白表达水平。结果表明,5-Aza-CdR及TSA对多发性骨髓瘤细胞具有明显生长抑制作用并呈剂量依赖性(P<O.05);与5-Aza-CdR及TSA单药组比较,联合用药组对细胞的抑制作用更强,细胞凋亡率明显升高(P<0.05);对照组RPMI 8226细胞DLC-1基因微弱表达,5-AzacdR组DLC-1基因表达增强,且呈剂量依赖性重新表达(P<0.05),TSA虽不能诱导基因重新表达,但两药联合应用时可明显增强细胞DLC-1基因的表达;实验组与对照组多发性骨髓瘤细胞相比,rhoA及Rac1蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论:5-Aza-CdR及TSA能有效的逆转RPMI 8226细胞DLC-1基因的表达,并明显增强对多发性骨髓瘤细胞的生长抑制及促凋亡作用。这种抑制作用可能与其抑制Rho/ROCK信号途径有关。

两种鼠血清与两种培养基对PK15细胞培养的比较

为比较研究DMEM培养基和RPMI-1640培养基对PK15细胞的培养效果,选择效果好的作为基础培养基,用大鼠血清和小鼠血清分别以不同量添加进行培养,用细胞显微病变(CPE)观察法和四甲基偶氮唑盐(MTT)测定法测定其对细胞生长的影响,为血药试验选择试验动物提供依据。结果表明:DMEM培养基较RPMI-1640培养基对PK15细胞的培养效果好,加5%大鼠血清或2.5%小鼠血清配制DMEM培养基的培养,对PK15细胞的培养生长无副作用,即两种血清的无毒安全浓度分别为5%和2.5%。

si RNA干扰β-catenin基因对多发性骨髓瘤细胞耐药性的影响

目的:探讨小片段RNA(siRNA)干扰β-catenin基因表达对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226耐药性的影响。方法:体外培养多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226,通过药物浓度梯度递增法建立马法兰耐药细胞模型;β-catenin-siRNA瞬时转染耐药细胞株,采用CCK-8法检测转染前后细胞对马法兰的敏感性变化,应用qRTPCR、Western-blot法分别检测β-catenin基因和蛋白表达水平的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:耐药骨髓瘤细胞经β-catenin-siRNA转染后对马法兰的IC50值由(5.29±0.19)μmol/L降至(1.88±0.64)μmol/L。Western-blot法检测显示,瞬时转染β-catenin-siRNA后β-catenin蛋白表达水平明显较转染前降低;转染后马法兰诱导细胞凋亡率由(35±0.5)%升高到(54±0.4)%,提示β-catenin基因可能与细胞耐药性相关,干扰β-catenin基因表达可提高耐药骨髓瘤细胞对于马法兰的敏感性。结论:β-catenin-siRNA干扰可抑制Wnt/β-catenin信号途径中β-catenin基因表达,抑制细胞增殖,增强马法兰对耐药骨髓瘤细胞株RPMI-8226毒性,增加细胞凋亡率。

miRNA-21种子序列反义核酸及抗多发性骨髓瘤应用

成熟microRNA的种子序列通过与其靶mRNA的3'-UTR区完全互补结合,发挥负性调节作用.针对miR-21的种子序列设计并合成8个碱基的微小反义核酸(tiny anti-miR-21,t-antimiR-21),研究t-antimiR-21对多发性骨髓瘤的抑制效应.利用LipofectamineTM2000转染多发性骨髓瘤RPMI-8266细胞系,激光共聚焦显微镜检测荧光标记的反义寡核苷酸的细胞内定位,流式细胞仪检测转染效率;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测细胞增殖抑制率;台盼蓝拒染法测活细胞数;Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果显示:t-antimiR-21主要定位于细胞质,与antimiR-21具有相同的转染效率,但是t-antimiR-21转染后降解较快.t-antimiR-21显著抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,最佳作用浓度为0.4μmol/L,最佳作用时间为48 h.结果表明t-antimiR-21可用于血液系统相关肿瘤的实验治疗,miRNA-21可作为多发性骨髓瘤基因治疗的潜在靶点.

miR-155种子序列的反义寡核苷酸对抗多发性骨髓瘤的作用

目的:探讨针对miR-155种子序列的微小反义核酸(tiny antimiR-155,t-antimiR-155)对多发性骨髓瘤细胞的抑制效应。方法:化学合成t-anti miR-155,通过脂质体转染多发性骨髓瘤RPMI-8266细胞株;实验分为t-antimiR-155组、随机对照组(SCR)和空白对照组;通过MTT法检测细胞增殖抑制率;使用细胞集落形成实验观察集落形成情况;流式细胞术(Annexin V/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果:(1)MTT筛选t-antimiR-155显著抑制RPMI-8266细胞生长的浓度,t-antimiR-155的最佳浓度是0.4μmol/L,最佳作用时间是转染后48 h。(2)细胞集落形成实验显示,相比于SCR组,t-antimiR-155组细胞形成集落的能力减弱,集落形成率显著降低。(3)相比于SCR组,t-antimiR-155组的细胞凋亡率明显增加,差异显著。结论:t-antimiR-155可能通过干扰miR-155表达有效抑制多发性骨髓瘤细胞的进展;miR-155可能作为多发性骨髓瘤基因治疗的潜在靶点。

RPMI-1640和DMEM/F12培养基对大鼠颈环上皮细胞培养的比较研究

目的:比较大鼠颈环上皮细胞在不同培养基中的生长状况。方法:分离培养大鼠颈环上皮细胞,分别采用RPMI-1640和DMEM/F12两种培养基培养,用倒置显微镜观察细胞的生长状态,MTT比色法检测细胞增殖活性。结果:倒置显微镜下,两组细胞在接种24 h后细胞大量贴壁并伸展,14 d时RPMI-1640组细胞呈现明显的凋亡现象,DMEM/F12组细胞生长状态良好。两种方法培养的颈环上皮细胞增殖活性差异有显著性意义(P﹤0.05)。结论:DMEM/F12培养基较RPMI-1640更适合颈环上皮细胞的贴壁及增殖。