山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30基因的转录水平。结果显示,获得的目的基因片段大小与预期结果相符,该基因与Gen-Bank数据库中RPO30基因序列的同源性为97%。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,转染后第48小时,阳性细胞率达到80.1%;经RT-PCR检测,细胞内有RPO30基因的转录。证实,已成功构建了RPO30基因与EGFP基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。

山羊痘病毒RPO30蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了研究山羊痘病毒RNA聚合酶亚基RPO30蛋白功能,构建了其原核表达质粒pET28a-RPO30和pGEX-6p-1-RPO30,并进行了诱导表达和纯化。将纯化的His-RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠,并将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过筛选得到了能够稳定分泌与RPO30蛋白特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株7E5。对该单克隆抗体的轻链和重链类型进行测定,发现其重链为Ig G2b亚型,轻链为κ亚型。经测定,单克隆抗体7E5的腹水效价可达1∶128000。RPO30单克隆抗体的制备将为该蛋白功能的研究提供有力工具。