小鼠RPS20基因miRNA干扰载体的构建及鉴定

目的构建小鼠RPS20 miRNA干扰载体,进行载体质粒的提取及鉴定,以进行细胞转染实验。方法针对小鼠RPS20基因miRNA序列,设计合成阴性对照及4对目标基因oligo,采用载体构建试剂盒进行重组克隆,经过退火、连接及转化后,进行测序及质粒提取鉴定。结果测序结果提示序列构建完全正确,电泳结果提示质粒大小正确,纯度较高。结论成功构建了针对于小鼠RPS20基因的miRNA干扰载体,测序及电泳结果提示,所构建序列可用于后续转染实验。

小鼠RPS20基因miRNA干扰对CT26细胞生长的影响

目的构建4对小鼠RPS20(ribosomal protein S20,RPS20)miRNA质粒载体,采用RNA干扰的方法干扰CT26细胞RPS20基因,观察干扰后对CT26细胞RPS20 mRNA、蛋白表达及细胞增殖的影响。方法采用荧光定量PCR及Western-Blot检测干扰后RPS20 mRNA及蛋白的表达,采用MTT法和3-H胸腺嘧啶核苷(3-HTdR)法检测干扰后细胞增殖能力的改变。结果 RNA干扰RPS20基因后,CT26细胞RPS20 mRNA表达水平下降,蛋白表达水平降低,肿瘤细胞生长受到一定程度的抑制。结论 CT26细胞RPS20基因的部分缺失,依然可以抑制细胞的正常生长,进一步提示了RPS20在生命活动中的重要作用。

绵羊RPS20基因的生物信息学分析

核糖体蛋白20基因(ribosomal proteinS20,RPS20)是一类参与蛋白质生物合成及对细胞增殖、分裂、分化、凋亡具有调控作用的基因,广泛存在于多种动物体内。为探究RPS20基因在绵羊体内的功能,运用生物信息学数据库及其软件分析了该基因及其编码的产物。结果发现,绵羊RPS20基因总共编码了119个氨基酸残基,所编码的蛋白质分子式为C_(587)H_(995)N_(173)O_(171)S_(5),分子质量为13.37271 KDa,等电点pI为9.95。通过基本理化性质的分析可知,绵羊RPS20蛋白是稳定性强、具亲水性的非分泌蛋白,不含信号肽序列且无跨膜结构。亚细胞定位结果表明,其编码产物主要存在于细胞质中(65.2%)。绵羊与牛、马、黑猩猩、野生双峰驼等哺乳动物的RPS20蛋白相似度均为100%。该蛋白的二级结构和三级结构主要以无规卷曲、α螺旋和β折叠组成。

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白与宿主RPS20蛋白相互作用研究

为筛选并鉴定与猪脑心肌炎病毒(EMCV) VP1蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交系统筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库。酵母共转化和免疫共沉淀试验表明VP1和RPS20蛋白之间存在特异性相互作用。激光共聚焦试验显示,过表达的VP1和RPS20共定位于细胞质中。本研究初步证实了RPS20与EMCV VP1蛋白之间的相互作用,为进一步研究RPS20蛋白在EMCV感染过程中的生物学功能奠定了基础。

TLR4/NF-κB信号通路激活LncRNA RP11-20G6调控慢性阻塞性肺疾病气道炎症和重塑

目的探讨LncRNA RP11-20G6.3和Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路在调控慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道炎症和重塑中的作用。方法采用野生型(WT)和TLR4基因敲除(KO)C57BL/6雄性小鼠为研究对象,构建COPD模型。采用HE染色和Masson三色染色进行组织学评价;免疫印迹分析TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。通过RNA测序与功能富集分析确定差异表达的LncRNAs,利用RNAhybrid对内源竞争RNA(ceRNA)网络进行预测。结合荧光素酶报告探讨基因之间的关系。结果在COPD模型中,与WT小鼠相比,TLR4-/-小鼠肺组织炎症减弱,肺组织NF-κB相关蛋白表达、BALF中炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)]水平以及Masson三色染色面积降低。RNA测序与功能富集分析确定RP11-20G6.3是差异表达lncRNAs之一,RP11-20G6.3在COPD患者的肺组织中上调,并与FEV1/用力肺活量的比值(FEV1%)相关(ρ=0.549,P=0.047)。RP11-20G6.3质粒干预加重了TLR4-/-COPD小鼠肺组织炎症,以及支气管周围Masson三色面积和BALF中炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平提高。荧光素酶报告基因检测显示,RP11-20G6.3在COPD中充当miR-34c-5p的ceRNA,并通过海绵作用使后者上调Col1a1。结论TLR4/NF-κB将COPD损伤信号传递并激活下游RP11-20G6.3/miR-34c-5p/Col1a1的ceRNA网络触发气道炎症、重塑。