归龙丸对高糖诱导的RSC96神经膜细胞分泌TNF-α、IL-10的影响

目的:评估归龙丸对高糖诱导的大鼠神经膜细胞(rats schwann cell,RSC96)分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、血清白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)的影响。方法:将RSC96神经膜细胞复苏及培养,在含17 mmol/L的葡萄糖培养基中培养48 h。分为S1组(维生素D_(3)+等渗乙醇溶液)、S2组(维生素D_(3)+等渗乙醇溶液+归龙丸高剂量)、S3组(维生素D3+等渗乙醇溶液组+归龙丸中剂量)、S4组(维生素D_(3)+等渗乙醇溶液组+归龙丸低剂量)、S5组(维生素D_(3)+CYP24A1抑制剂genistein的乙醇溶液)等5组,S1~S4组中分别加入维生素D_(3)及与其等浓度的乙醇,S5组加入维生素D_(3)及CYP24A1抑制剂genistein的乙醇溶液,作用48 h。48 h后应用酶联免疫吸附试验法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-10的水平,并通过相应的基因引物检测RSC96细胞内CYP24A1m表达水平。结果:经归龙丸和CYP24A1抑制剂组处理后的神经膜细胞,其TNF-α的水平下降,IL-10水平上升,CYP24A1m表达水平下调。结论:归龙丸可能通过抑制CYP24A1蛋白表达,间接调节维生素D_(3)使神经膜细胞TNF-α分泌减少、IL-10分泌增加,从而对高糖诱导的RSC96神经膜细胞起到保护作用。

槲皮素通过Akt-mTOR途径上调高糖培养RSC96细胞的自噬

目的探讨槲皮素对高糖离体培养的RSC96细胞自噬变化规律的影响。方法 RSC96细胞培养于含有槲皮素的高糖培养基中,超微结构应用透射电子显微镜观察,用免疫荧光法、Western blot法检测Beclin1、LC3Ⅱ、磷酸化的Akt及磷酸化的m TOR蛋白表达,用实时荧光定量PCR法检测Beclin1 mRNA和LC3B mRNA的转录。结果高糖造成RSC96细胞Beclin1和LC3Ⅱ的表达下调,增加Akt和m TOR的磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),造成病理形态改变,减少自噬体数量。槲皮素能够上调Beclin1和LC3Ⅱ的表达,下调Akt和m TOR的磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),修复病理损伤,增加自噬体数量。结论槲皮素通过下调Akt-m TOR途径磷酸化水平而增加高糖培养RSC96细胞的自噬。

大鼠骨髓间充质干细胞促进RSC96细胞凋亡并抑制其增殖和迁移

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠RSC96施万细胞增殖及迁移的影响。方法全骨髓细胞贴壁法分离并提取SD大鼠BMSC,倒置显微镜观察第3代BMSC形态;流式细胞术检测细胞表面CD19、CD34、CD73、CD105;第3代BMSC经成脂成骨诱导液分别诱导3周和2周后,分别应用油红O染色和碱性磷酸酶检测BMSC的多向分化能力。应用24 mm共培养板,将第3代BMSC与RSC96细胞共培养24 h,采用MTT法和平板克隆形成实验检测RSC96细胞增殖及克隆形成能力;划痕实验及TranswellTM小室实验检测RSC96细胞的迁移能力;Western blot法检测RSC96细胞Bax和Bcl-2蛋白表达水平。结果SD大鼠第3代BMSC显微镜下呈梭形、旋涡状排列,形态大小相似;BMSC表面标志CD73、CD105高表达,造血干细胞表面标志CD34和淋巴细胞表面标志CD19低表达;BMSC经成脂诱导培养3周后,细胞有大量脂滴;经成骨诱导培养2周后,碱性磷酸酶染色呈阳性;BMSC与RSC96细胞共培养后,与对照组相比,RSC96细胞的增殖活性显著降低,克隆形成能力显著减弱、细胞迁移能力降低;共培养后RSC96细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白表达降低。结论 BMSC能促进RSC96细胞凋亡,抑制其增殖、迁移。

慢病毒介导PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型建立

背景:第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是一种抑癌基因,可以通过调节PI3K/AKT/mTOR等信号通路在细胞增殖凋亡中起到作用。最新研究证实,PTEN可在脊髓损伤、周围神经缺损等骨科疾病中起到重要作用,而相关的细胞模型却鲜有报道。目的:构建携载大鼠PTEN基因的慢病毒载体,建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型。方法:设计大鼠PTEN基因RNAi序列,将其构建并包装成可转染的慢病毒,转染RSC96施万细胞后,通过RT-PCR检测RSC96施万细胞中PTEN基因的表达情况。结果:成功构建病毒滴度为8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒,将其转染RSC9施万细胞后,细胞中PTEN基因的相对表达量为0.2322±0.0187,敲减效率为76.78%,与阴性对照慢病毒转染组(1.0044±0.0022)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型,为研究PTEN基因相关的创伤骨科、脊柱外科、手外科疾病提供实验基础。

不同剂量枸杞多糖对高糖诱导的RSC96 雪旺细胞增殖的影响比较

目的研究不同剂量枸杞多糖(LBP)对高糖诱导的RSC96雪旺细胞增殖的影响。方法分别采用不同葡萄糖浓度(12.5、25、50、100 mmol/L)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)培养大鼠RSC9648h,用四唑盐比色法(MTT)检测不同葡萄糖浓度对RSC96细胞活力的影响。确定下一步实验的正常对照组及高糖组的葡萄糖浓度,在此基础上给予不同剂量(100、200、400、800μg/mL)LBP培养48 h,用MTT法检测不同剂量LBP对RSC96细胞增殖的影响。结果在不同浓度的葡萄糖中,25 mmol/L葡萄糖浓度组RSC96细胞活力最高,100 mmol/L组RSC96细胞活力下降最为显著;与高糖组比较,200、400、800μg/mL的LBP均有促进RSC96细胞增殖的作用,LBP为400μg/mL作用最明显(P<0.05)。结论LBP为400μg/mL对高糖诱导的RSC96细胞增殖作用最佳。

人参环氧炔醇对体外培养RSC96细胞的实验观察

目的研究人参环氧炔醇(Panaxydol,PND)对体外培养RSC96细胞神经营养因子及髓鞘蛋白表达的影响并探讨其机制。方法用含不同血清浓度的培养基培养RSC96细胞,MTT检测其增殖能力,以获取最适宜RSC96细胞体外生长的血清浓度。在适宜的血清培养基中加入PND(10μmol/L)处理RSC96细胞,以RT-PCR、western blot及ELISA检测RSC96细胞NGF和BDNF的表达。另外,预先在培养基中加入钙离子通道阻滞剂尼非地平探讨PND可能的作用途径。结果培养基血清浓度为4mmol/L时,RSC96细胞生长形态最接近于原代Schwann细胞。PND增强RSC96细胞表达和释放NGF和BDNF(P<0.05)。尼非地平的使用,则削弱了PND对RSC96细胞的作用(P<0.05)。结论在适宜的血清培养基中,体外培养的RSC96细胞可替代原代Schwann细胞,作为研究药物对它的影响及机制的细胞模型。PND增强RSC96细胞的生物活性的作用机制可能通过Ca2+信号途径介导。

大鼠骨髓间充质干细胞培养上清液对RSC96细胞生物学功能的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)培养上清液对大鼠RSC96细胞生物学功能的影响。方法:体外培养、纯化SD大鼠BMSC并进行鉴定;收集第3代BMSC培养上清液(BMSC-CM);采用MTT法检测BMSC-CM对RSC96细胞增殖的影响;平板克隆实验分析BMSC-CM对RSC96单个细胞增殖的影响;划痕实验和TranswellTM小室实验分析BMSC-CM对RSC96细胞迁移的作用,Western blot法检测BMSC-CM对RSC96细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的改变。结果:SD大鼠第3代BMSC形态呈长梭形,旋涡样生长;成骨染色为阳性结果;成脂诱导后有脂滴出现;BMSC-CM作用后抑制RSC96细胞的增殖和迁移能力,且作用后的RSC96细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白表达降低。结论:BMSC-CM促进RSC96细胞凋亡,抑制其增殖和迁移。

大鼠雪旺细胞系RSC96条件培养液对少突胶质前体细胞的体外增殖作用

目的观察大鼠雪旺细胞系RSC96细胞条件培养液(RSC96-CM)对少突胶质前体细胞(OPCs)增殖的影响,探讨其作用机制。方法应用免疫粘附法从胚胎15d的SD大鼠脊髓分离OPCs,应用Brd U掺入实验检测OPCs的增殖,应用RT-PCR技术检测PDGF-AA和bFGF在RSC96细胞的表达,应用ELISA技术检测RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF蛋白的浓度,以特异性抑制剂阻断观察PDGF-AA和bFGF在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用,以特异性抑制剂观察ERK和JNK信号途径在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用。结果不同浓度的RSC96-CM培养的OPCs,其BrdU+细胞的比例与对照组相比均显著增加(P<0.05),其中,在含50%RSC96-CM的培养液中培养的OPCs的BrdU+细胞的比例达高峰。RT-PCR证实RSC96细胞显著表达PDGF-AA和bFGF的mRNAs,ELISA结果发现,RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白浓度分别是我们前期报道的B104CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白水平的0.87倍和0.92倍。PDGFR的特异性抑制剂AG1295和bFGFR特异性抑制剂PD173074均显著降低RSC96-CM诱导的OPCs增殖;此外,Erk1/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制SP600125的预孵也显著降低RSC96-CM诱导的BrdU+OPCs的比例(P<0.01)。结论 RSC96-CM显著诱导OPCs的增殖,其通过RSC96分泌的PDGF-AA和bFGF激活Erk1/2和JNK信号途径而发挥作用;RSC96-CM也可以作为OPCs常规培养的扩增剂。

三种转染试剂对RSC96细胞miRNA转染效率及细胞毒性影响的比较

目的比较三种转染试剂对大鼠施万细胞(Schwann cell,SC)mi RNA的转染效率和细胞毒性,为更好地研究SC创造条件。方法以大鼠SC株(RSC96)为研究对象,采用Lipofectamine 2000、Fu GENE6 Transfection Reagent和Super Fectin II Reagent分别转染绿色荧光素FAM标记的mi RNA阴性对照产品,比较和分析三者的转染效率以找出转染效率最高的转染试剂,并以CCK-8法细胞活性检测和TUNEL凋亡染色对这三种转染试剂的细胞毒性进行观察。结果 Fu GENE6 Transfection Reagent不适合RSC96转染mi RNA,lipofectamine 2000转染效率偏低,Super Fectin II Reagent转染效率能够满足实验要求,但其细胞毒性较大,应注意换液。结论 Super Fectin II Reagent可用于RSC96转染mi RNA,转染后宜进行换液以减少毒性。

Wnt5a基因慢病毒的构建与RSC96雪旺细胞的感染研究

目的 构建大鼠Wnt5a基因慢病毒并感染RSC96雪旺细胞,观察慢病毒感染情况及Wnt5a表达情况。方法 设计大鼠Wnt5a基因特异性RNAi序列,构建并包装成可感染细胞的慢病毒,感染RSC96雪旺细胞后通过Celigo观察细胞中荧光表达,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测细胞中Wnt5am RNA的表达情况。结果 构建的Wnt5a基因慢病毒在感染RSC96雪旺细胞后可表达绿色荧光,细胞中Wnt5am RNA的平均表达量为0.206±0.056。结论 Wnt5a基因慢病毒构建成功,可为研究Wnt5a调控的周围神经损伤修复时雪旺细胞功能的相关研究提供便利。

糖痛方对高糖诱导RSC96细胞凋亡与增殖的影响

目的筛选中药糖痛方的体外作用最佳剂量。方法采用含5~125 mmol/L不同浓度葡萄糖的DMEM培养基培养RSC96细胞,检测不同浓度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mg/m L)糖痛方高糖培养RSC96细胞增殖。采用含100、125 mmol/L葡萄糖培养基培养RSC96细胞72 h后,AV/PI凋亡试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡,计算细胞凋亡率;CCK-8法检测不同时点RSC96细胞增殖。结果 RSC96细胞在100、125 mmol/L葡萄糖培养基培养下发生凋亡,凋亡率分别为(7.46±0.96)%、(16.53±1.01)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度糖痛方可明显改善高糖对RSC96细胞增殖的抑制作用,24 h起效浓度为0.25 mg/m L;0.5、1.0、1.5 mg/m L 3个剂量糖痛方可明显抑制高糖诱导的细胞凋亡,与125 mmol/L高糖组比较,细胞凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论在3个不同剂量中,1.5 mg/m L糖痛方抑制细胞凋亡作用最佳。

丹酚酸B对代谢记忆环境下RSC96细胞的保护作用

目的:探讨丹酚酸B对代谢记忆环境下离体培养的RSC96细胞凋亡及炎性因子变化规律的影响。方法:RSC96细胞分别培养于低糖培养组(5.6 mmol/L)、代谢记忆(125 mmol/L高糖培养48 h,5.6 mmol/L低糖培养24 h)、丹酚酸B组(125 mmol/L高糖+1μmol/L丹酚酸B培养48 h,5.6 mmol/L低糖培养基+1μmol/L丹酚酸B培养24h)中,流式法检测ROS含量,Western blot法检测Cleaved-caspase 9,Cleaved-caspase 3,P65,IL-1β的表达。结果:代谢记忆环境可下调ROS含量,下调Cleaved-caspase 9,Cleaved-caspase 3,P65,IL-1β等蛋白的表达;丹酚酸B可上调ROS含量,下调Cleaved-caspase 9,Cleaved-caspase 3,P65,IL-1β等蛋白的表达。结论:代谢记忆环境下,丹酚酸B可能通过下调ROS引起细胞凋亡及炎性损伤保护RSC96细胞。

不同状态巨噬细胞对RSC96细胞NGF及Laminin表达的影响

目的研究不同活化状态的巨噬细胞与雪旺细胞株(RSC96)共培养条件下雪旺细胞神经营养因子(NGF)及层粘连蛋白(Laminin,LN)的表达情况。方法利用Transwell建立大鼠腹膜腔巨噬细胞和RSC96细胞的共培养体系,分别将RSC96细胞与未激活巨噬细胞、激活态巨噬细胞共培养;采用Real-time PCR检测、Western blot分析、以及酶联ELISA测定等研究手段,比较各组NGF及LN的表达差异。结果与未激活巨噬细胞共培养组RSC96细胞NGF表达增强,激活态组表达明显增强;而各组LN表达差异不明显。结论巨噬细胞对RSC96细胞NGF表达有促进作用,受其活化状态的影响,激活状态的巨噬细胞的促进作用更明显;对影响RSC96细胞迁移功能的LN的表达作用不明显,无统计学意义,有待进一步研究。

不同空间排列静电纺丝对RSC96细胞表达NGF及Laminin的研究

目的研究不同空间排列静电纺丝对雪旺细胞株(RSC96)神经营养因子(NGF)及层粘连蛋白(Laminin,LN)的表达情况。方法根据培养条件不同分3组,即平行静电纺丝培养组(A)、随机静电纺丝培养组(B)及膜上培养组(C)培养3天后用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(d T)逆转录酶得到c DNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行q PCR反应,检测NGF及LN的表达差异。结果平行静电纺丝组,随机静电纺丝组,膜上培养组上NGF基因表达依次递增,各组间差异明显;LN基因的表达依次递减,各组间差异明显。结论不同空间排列的静电纺丝对RSC96细胞表达NGF和Laminin影响不同,平行的静电纺丝有促进细胞向成熟分化的可能。

ALS相关突变型σ1R的激活促进大鼠施旺细胞RSC96的凋亡

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种渐进的致命的神经退行性疾病,症状为运动神经元损失所导致的肌肉萎缩和痉挛,大部分病人最后死于呼吸衰竭.对其致病机理的研究主要集中于对神经元的影响,而对施旺细胞在其中的作用至今仍未有报道.之前研究发现在一个青少年发病的ALS家族中,SIGMAR1基因编码区的一个碱基存在错位突变,该突变使Sigma-1型受体(σ1R)的102位氨基酸由谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q).本文通过在大鼠施旺细胞系(RSC96细胞)中过表达野生型及突变型σ1R来研究该突变对RSC96细胞凋亡的影响.实验结果表明在毒胡萝卜素(Thapsigargin)诱导的内质网压力和σ1R激动剂PRE084的刺激下,突变型σ1R使施旺细胞更倾向于凋亡,失去了对胞质Ca^(2+)调节的能力,并且对ADAM10具有更强的抑制作用.本研究提示σ1R突变也可能通过施旺细胞对ALS的病理过程起到作用.

消渴痹通胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞损伤的保护作用及其机制

目的:探讨消渴痹通胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞损伤的保护作用及其机制。方法:将RSC96雪旺细胞复苏及培养,采用免疫细胞化学法检测RSC96细胞的特异性蛋白S-100的表达情况,进行雪旺细胞鉴定;以高糖诱导造成RSC96雪旺细胞损伤,梯度高糖浓度比较,确定后续研究所采用的高糖浓度;通过MTT法检测消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用,采用免疫组织化学检测NGF蛋白水平和蛋白质印迹法检测P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白水平。结果:1)RSC96雪旺细胞存活率随着消渴痹痛胶囊药物浓度的升高而增加(P<0.05)。2)NGF蛋白表达量随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加(P<0.05)。3)p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表达下调,且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加而减少(P<0.05)。结论:消渴痹痛胶囊可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活,从而下调caspase-3蛋白的表达水平,抑制雪旺细胞的细胞凋亡,同时又上调NGF的表达水平,为周围神经的髓鞘细胞提供神经营养物质,从而对高糖诱导的RSC96雪旺细胞起到保护作用。

犬ADMSCs对低氧缺糖模型RSC96细胞增殖、迁移及相关基因表达的影响

为了探究犬脂肪间充质干细胞(ADMSCs)促进髓鞘修复的分子机制,本试验以大鼠施万细胞(RSC96)为对象,模拟脊髓损伤(SCI)时脊髓组织低氧缺糖的微环境,制备低氧缺糖RSC96细胞模型,通过离体试验研究犬ADMSC对低氧缺糖RSC96细胞增殖、迁移及相关基因表达的影响。设空白对照组、模型对照组、MSC共培养组及空白培养基组,空白对照组为常规培养的RSC96细胞,其余三组为低氧缺糖模型RSC96细胞。在37℃5%CO_(2)培养箱中培养细胞,在造模后0、12、24h对不同组别进行拍照并使用软件测定划痕面积,计算迁移率。24 h后采取CCK-8法检测各组间OD值,并测定细胞增殖(NGF、NT-3)、迁移(Nrg-1)相关基因mRNA的表达情况。结果表明,24h后MSC共培养组的OD值和迁移率显著高于空白培养基组与模型对照组(P<0.05),且相关基因的mRNA表达量均高于其他三组,说明脂肪间充质干细胞可通过与RSC96共同作用来促进髓鞘修复。

高糖对RSC96雪旺细胞的损伤机制

目的观察高浓度葡萄糖对雪旺细胞增殖及凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法将体外培养的RSC96雪旺细胞分为正常对照组(25 mmol/L)和高糖组(100 mmol/L),分别应用M TT及流式细胞技术观察高糖对RSC96细胞增殖及细胞凋亡的影响。应用Western blotting观察高糖对Lipin-1、神经生长因子(NGF)蛋白表达的影响,并应用免疫荧光技术进一步验证在高糖刺激下Lipin-1蛋白表达变化。结果与正常对照组比较,高糖组对RSC96细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05)。与正常对照组晚期凋亡率(1.56±0.72)%相比,高糖组细胞晚期凋亡率(12.40±0.65)%明显增加。高糖显著降低Lipin-1和NGF蛋白表达(P<0.05)。结论高糖显著抑制雪旺细胞增殖并促进细胞凋亡;同时显著降低了Lipin-1和NGF的蛋白表达。提示高糖对神经细胞的损伤作用可能存在多种机制。

敲除L-periaxin基因的大鼠RSC96细胞系的建立

轴周蛋白(Periaxin)是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的蛋白,编码Periaxin的基因经由选择性剪接产生两种蛋白异构体L-periaxin和S-periaxin,对髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在Periaxin基因上已发现有18种不同的位点突变导致外周脱髓鞘神经疾病腓骨肌萎缩症4F亚型(CMT4F)的发生。利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向基因敲除技术对大鼠RSC96细胞的periaxin基因进行敲除,根据TALENs设计原则,确定L-periaxin基因的敲除靶点在其编码NLS结构域部分,设计相应的TALEN左臂与右臂的识别序列,构建含上述识别序列的L-periaxin基因敲除载体TALEN-L和TALEN-R,并将其转入RSC96细胞,经嘌呤霉素药物筛选,获得L-periaxin基因敲除细胞株,经测序确认大鼠RSC96细胞中的基因组中L-periaxin基因区段已被敲除,成功构建了L-periaxin基因敲除细胞模型。计算L-periaxin基因敲除载体的突变率为21.6%。Western blotting实验证明,在RSC96细胞中只能检测到S-periaxin蛋白的表达。通过流式细胞术及MTT实验检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度,发现敲除L-periaxin基因的细胞生长速度缓慢,G1期细胞增多,S期细胞减少。

葛根素对高糖诱导的RSC96细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响

目的探讨葛根素对高糖诱导的RSC96细胞损伤的保护作用是否与自噬调节有关。方法建立体外RSC96细胞高糖损伤模型,根据Westernblot检测CleavedCaspase-3蛋白判断造模成功与否。通过CCK-8法确定葛根素干预浓度。免疫细胞化学法检测Beclin-1蛋白的表达;Western blot检测Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1蛋白的表达。结果与高糖组相比,葛根素预处理可显著提高高糖诱导后RSC96细胞的存活率(P<0.05),抑制Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P<0.05),抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达(P<0.05),增强p62蛋白的表达(P<0.05)。结论葛根素可改善由高糖诱导的RSC96细胞损伤,其机制可能与其抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达、提高p62蛋白表达有关。[营养学报,2020,42(3):281-286]